6. Chuẩn Rubella dương tính 8 Thang ADN chuẩn 100bp
3.2.2.3. Giải trình tự nucleotit gen E1 virút Rubella
Quy trình giải trình tự chuỗi ADN gen E1 virút Rubella được xây dựng dựa trên quy trình giải trình tự ADN virút sởi như đã trình bày ở trên.Đoạn gen ADN 380 bp virút Rubella khuếch đại sau RT-PCR được tinh sạch, theo quy trình sử dụng enzym ExoSAP-IP. Sản phẩm ADN tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%
đạt tiêu chuẩn cho thực hiện giải trình tự. Sử dụng máy giải trình tự tự động Beckman Counter để xác định trình tự chuỗi nucleotit gen E1 virút Rubella. Hình 3.2.2.3 miêu tả
một phần đồ thị của các đỉnh sóng sắc ký với 4 mầu tương ứng với các ddNTP. Kết quả
giải trình tựđạt chất lượng cao qua hình ảnh trải đều và tách biệt rõ ràng của các đỉnh cường độ ánh sáng. Kết quả phân tích được thực hiện trên máy vi tính Dell Precision PWS670 hệ Window XP (version 2002, SP1) với phần mềm BioNumerics (version 5.1) (Applied Maths, Bỉ). Bằng phương pháp giải trình tự, các đoạn ADN có kích thước từ khoảng 370 bp - 385 bp của ADN gen E1 virút Rubella phân lập từ các vụ
Hình 3.2.2.3. Một phần kết quả giải trình tự ADN genom E1 Rubella bằng máy Beckman Counter
Sử dụng chương trình BLAST để phân tích và so sánh trình tự ADN genom E1 Rubella VN với các chủng chuẩn từ cở sở dữ liệu Ngân hàng gen NCBI. Bảng 3.2.2.3 miêu tả tỉ lệ tương đồng giữa trình tự ADN chủng Rubella VN với trình tự ADN chủng quốc tế. Kết quả so sánh cho thấy, trình tự gen E1 Rubella VN có tỉ lệ tương đồng là 97% so với RVs/Kent.GBR/21.03 và 98% với RVi/Chendu.Sichuan.CHN/18.06/1 mới công bố gần đây nhất (31/12/2009). Theo chuẩn mực định danh của WHO, tỉ lệ khác biệt giữa genotyp RGI và RGII >7%. Tỉ lệ biến đổi tối đa giữa các virút RGI khoảng 5,8% và virút RGII (2A, 2B, 2C) là 5,5%. Phạm vi biến đổi giữa virút RGII: 2A và 2B trung bình khoảng 7% [6], [29], [34].
Bảng 3.2.2.3. So sánh tỉ lệ tương đồng giữa trình tự gen E1 chủng Rubella Việt Nam với chủng Rubella quốc tế theo chương trình BLAST
# GenBank Nội dung Tỉ lệ tương đồng
FJ875057.1 Rubella virus strainRVi/Chendu.Sichuan.CHN/18.06/1 E1 protein
gene, partial cds 98%
EF210066.1 Rubella virus strainstructural protein E1 gene, partial cds RVs/Kent.GBR/21.03[2B]CRS 97%
GU174756.1 Rubella virus strain RVs/Ontario.CAN/35.09[2B]CRS glycoprotein (E1) gene, partial cds
95%
# GenBank Nội dung Tỉ lệ tương đồng
GU353072.1
Rubella virus isolate
RVs/Waukesha.WI.USA/15.08[2B] polyprotein
gene, partial cds 94% AY326343.1 Rubella virus isolate MTS/-IND00 polyprotein gene, partial cds 94%
AY968220.1 Rubella virus strain RVI/WA.USA/16.00 structural protein gene, complete cds 94%
AB003340.1 Rubella virus gene for E1 protein, partial cds, strain:379 94%
AF039134.1 Rubella virus strain BAS polyprotein gene, partial cds 94%
EU240899.2 Rubella virus strain RVs/Sheffield.GBR/13.07[2B]CRS structural protein E1 gene, partial cds
94%
Điểm mới nổi bật của công trình nghiên cứu này là lần đầu tiên quy trình giải trình tự đoạn gen E1 virút Rubella được xây dựng và thử nghiệm thành công. Những kết quả của công trình được coi là kết quảđầu tiên vì cho đến nay chưa có các công bố
của các tác giả trong và ngoài nước về trình tự của chủng Rubella lưu hành tại VN. Một số công trình trong nước liên quan đến Rubella được công bố khoa học. Tuy vậy, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào mục tiêu giám sát dịch tễ và chẩn đoán huyết thanh học bệnh Rubella.
Từ các kết quả thu được cho phép nhận định, genotyp virút Rubella VN có biến
đổi so với các chủng Rubella trên Thế giới. Trình tự nucleotit gen E1 Rubella thu được từ công trình nghiên cứu này có điểm mới và đạt tiêu chuẩn cho đăng ký bổ sung vào danh mục dữ liệu gen glycoprotein E1 virút Rubella của Ngân hàng gen NCBI.
(Ghi chú: Trình tự chuỗi nucleotit gen E1 của các chủng Rubella VN được trình bày trong phần Phụ lục I - Sản phẩm Khoa học & Công nghệ)