2.1. Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng Nested-PCR
Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng Nested-PCR bằng cách trộn lẫn thành phần tham gia phản ứng theo Bảng 3, trừ mẫu ADN. Tính tổng số phản ứng cần thực hiện (gồm cả mẫu chuẩn dương tính và âm tính). Chuẩn bị một thể tích hỗn dịch cần thiết lớn hơn 10% so với tổng số lượng các phản ứng. Bảng 3. Thành phần phản ứng cho Nested-PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích/phản ứng Dung dịch đệm (Invitrogen) 2X 2,5 µl dNTPm 2 mM 2,5 µl MgCl2 (Invitrogen) 50 mM 0,75 µl Mồi xuôi (n3) 10 µM 1,25 µl Mồi ngược (n4R) 10 µM 1,25 µl
Platinuim Taq DNA polymerase (Invitrogen) 5 U/ µl 0,15 µl
Nước cất vô trùng (RNase-free) 11,6 µl
Mẫu ADN 10 - 100 ng/ µl 5 µl
6
thể tích hỗn dịch đã chuẩn bị theo cách trên vào các ống PCR (20 µl/ống).
2.3. Thêm mẫu ADN vào từng ống PCR.
Thêm 5 µl mẫu ADN virút sởi sau RT-PCR vào từng ống PCR đã chứa 20 µl hỗn dịch ở trên. Tổng thể tích cuối cùng cho mỗi ống PCR đạt 25 µl.
2.4. Thực hiện phản ứng Nested-PCR
- Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Nested-PCR được cài đặt trên máy chạy PCR theo Bảng 4
Bảng 4. Điều kiện chu kỳ nhiệt Khởi đầu PCR 95°C 3 phút Chu kỳ thứ nhất: 10 chu kỳ 95°C 30 giây 57°C 30 giây 72°C 1 phút
Chu kì thứ hai 25 chu kỳ + 5 giây/ chu kỳ
95°C 30 giây
57°C 30 giây
72°C 1 phút
Kết thúc 72°C 10 phút
4°C ∞
- Đặt các ống PCR gồm đủ các thành phần phản ứng vào máy PCR. Khởi động chương trình Nested-PCR đã được cài đặt.
2.6. Bảo quản sản phẩm ADN sau Nested-PCR
Sản phẩm Nested-PCR được giữở 4°C hoặc -20 °C tuỳ thuộc yêu cầu thực nghiệm
2.5. Kiểm tra trên gel Agarose 2%
- Chuẩn bị gel agarose 2% trong TBE 1X: 2g agarose/100ml TBE 1X.
- Nhỏ mẫu: trộn 5µl sản phẩm ADN với 2µl Blue Bromophenol. Nhỏ 7 µl mẫu/giếng của bản gel agarose 2%.
- Đặt bản gel trong bểđiện di. Điện di: 150 V/30 phút.
- Nhuộm gel: ngâm bản gel trong đệm TBE 1X + edithium bromid 30 phút. - Chụp ảnh bản gel trênmáy gel doc (hoặc máy chụp Polaroid)
7
Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm ADN virút sởi sau Nested PCR
2.Chuẩn âm tính
3.4.5.6.7.8.9. Mẫu ADN virút sởi 10. Thang ADN chuẩn 100bp 10. Thang ADN chuẩn 100bp
Với các cặp mồi đặc hiệu, đoạn ADN đặc hiệu gen N virút sởi có kích thước 576 bp được tổng hợp.