II. RT-PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN ADN GEN E1 VIRÚT RUBELLA
1. Thang ADN chuẩn LMW 2.ADN sởi cắt bởi Mbo
QUY TRÌNH THỰC HIỆN 1 Tách chiết ARN virút
1. Tách chiết ARN virút
Toàn bộ ARN virút được tách chiết từ 280 µl dịch nuôi cấy tế bào Vero SLAM gây nhiễm chủng virút sởi/Rubella. Sử dụng Kit QIAamp Viral RNA Isolation (QIAgen, Mỹ). Quy trình tách chiết theo đúng thường quy đi kèm của bộ Kit.
2. Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng multiplex PCR
Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng multiplex-PCR bằng cách trộn lẫn thành phần tham gia phản ứng theo Bảng 1, trừ mẫu ARN. Tính tổng số phản ứng cần thực hiện (gồm cả mẫu chuẩn dương tính và âm tính). Chuẩn bị một thể tích hỗn dịch cần thiết lớn hơn 10% so với tổng số lượng các phản ứng.
3. Trộn hỗn dịch và phân chia lượng thích hợp vào ống PCR.
Trộn kỹ hỗn dịch bằng cách hút lên và xuống nhẹ nhàng một vài lần bằng pipet. Phân chia thể tích hỗn dịch đã chuẩn bị theo cách trên vào các ống PCR (22,5 µl/ ống).
4. Thêm mẫu ARN vào từng ống PCR.
Thêm 2,5 µl mẫu ARN virút sởi vào từng ống PCR đã chứa 22.5 µl hỗn dịch ở trên. Tổng thể tích cuối cùng cho mỗi ống PCR đạt 25 µl.
4 Dung dịch đệm (QIAgen) 5X 5 µl dNTPm 10 mM 1 µl Q solution (QIAgen) 5X 3 µl Mồi xuôi (Sar 1F) 10 µM 1,2 µl Mồi ngược (Sar 1R) 10 µM 1,2 µl Mồi xuôi (Ru 1TR) 10 µM 1,2 µl Mồi ngược (Rube 1F) 10 µM 1,2 µl Enzyme mix polymease (QIAgen) 1unit/µl 1 µl Nước cất vô trùng (RNase free) 7,7 µl
Mẫu ARN 10-100 ng/µl 2,5 µl
Tổng thể tích 25 µl
5. Thực hiện phản ứng RT-PCR
- Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR được cài đặt trên máy chạy PCR theo Bảng 2
Bảng 2. Điều kiện chu kỳ nhiệt multiplex PCR
Phiên mã ngược (RT) 50°C 30 phút 94°C 15 phút 40 Chu kỳ 94°C 30 giây 60°C 30 giây 72°C 1 phút Kết thúc 72°C 10 phút 4°C ∞ - Đặt các ống PCR gồm đủ các thành phần phản ứng vào máy PCR. Khởi động chương trình RT-PCR đã được cài đặt.
5
- Nhỏ mẫu: trộn 5µl sản phẩm ADN với 2µl Blue Bromophenol. Nhỏ 7 µl mẫu/giếng của bản gel agarose 2%.
- Đặt bản gel trong bểđiện di. Điện di: 150 V/ 30 phút.
- Nhuộm gel: ngâm bản gel trong đệm TBE 1X + edithium bromid 30 phút. - Chụp ảnh bản gel trên máy gel doc (hoặc máy chụp Polaroid).
- Kiểm tra kích thước các đoạn ADN được nhân lên bởi multiplex PCR trên bản gel. - Kết quả kích thước đoạn ADN: Genom N virút sởi 443 bp
Genom E1 virút Rubella 380 bp
KẾT QUẢ MINH HOẠ
1 2 3 4 5 6 7
Hình 1.Ảnh điện di sản phẩm ADN virút sởi và Rubella sau
multiplex PCR
1,2. Mẫu ADN Rubella 3. Thang ADN chuẩn 100 bp 4,5. Mẫu ADN sởi
6. Mẫu chuẩn âm tính 7. Mẫu chuẩn dương tính
Tài liệu tham khảo
Maria del Mosquera, Fernandod de Ory, Monica Moreno, E.Echevarria. Simultaneous Detection of Measles Virus, Rubella Virus, and Parvovirus B19 by Using Multiplex PCR.
1