II. RT-PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN ADN GEN E1 VIRÚT RUBELLA
1. Quy trình ứng dụng phần mềm “BioNumerics Sequence Types”
1.1. Tạo thư mục chủ:
1.1.1. Khởi động phần mềm BioNumerics.
1.1.2. Trong chương trình BioNumerics Starup, ấn biểu tượng để vào New database winzard.
1.1.3. Nhập tên cho cơ sở dữ liệu, ví dụ: Rubella và ấn <Next> để vào bước thứ hai của New database winzard.
1.1.4. Trong bước thứ hai của New database winzard. Chọn <Yes> để tự động tạo ra các thư mục theo yêu cầu và ấn <Next> để vào bước thứ ba của New database winzard.
1.1.5. Trên màn hình hiển thị “Whether or not you want to create log file”. Ấn <Yes>
để tạo tập tin được khoá (log files) và ấn <Finish>.
1.5.6. Chọn kiểu cơ sở dữ liệu theo yêu cầu trong hộp thoại Setup new database. Ví dụ New connected database hoặc Local database. Ấn <Proceed> để bắt đầu công việc với cơ sở dữ liệu mới vừa tạo.
1.2. Xác định một kiểu trình tự mới:
Trong BioNumerics main window, chọn Experiments > Create new sequence type từ bảng chọn trên thanh công cụ, hoặc ấn trong Experiments panel phía bên phải màn hình, chọn New sequence type.
1.2.1. Cửa sổ New sequence type sẽ nhắc việc nhập tên cho dạng mới (new type). Nhập tên, ví dụ "Rubella VN". (Hình 1.2.1). Ấn <Next>.
1.2.2 Chọn kiểu trình tự: Nucleic acid sequence hoặc Amino acid sequence. Ví dụ:
chọn Nucleic acidsequence. (Hình 1.2.2).
4
Hình 1.2.1. New sequence type wizard Hình 1.2.2. New sequence type wizard
1.3. Nhập dữ liệu trình tự
Dữ liệu trình tự có thể gồm các nucleic hoặc các amino axit. Phần mềm BioNumerics bao gồm các công cụ nhập cho định dạng EMBL, GenBank, FASTA. Với chương trình dịch hợp ngữ (Asembler program) BioNumerics, các trình tự tiếp giáp từ phần trình tự có thể được lắp ráp. Asembler chấp nhận tập tin kí tự phẳng và
chromatogram (ABI, Beckman, Amersham).
1.3.1. Nhập dữ liệu từ trình tự Fasta.
1.3.1.1. Nếu chưa cài đặt Import plugin, Ấn hoặc vào File>Install/Remove plugin
đểmở cửasổ Plugin Installation(Những chương trình nhỏ có thểở dạng khả thi .exe hay dạng file .dll).
1.3.1.2. Chọn Import và ấn Install để kiểm tra sự cài đặt (Kí hiệu ‘x’ màu đỏ sẽ
chuyển sang kí hiệu ‘v’ màu xanh). Đóng cửa sổ Plugin Installation.
1.3.1.3. Chọn kiểu thí nghiệm Rubella VN.
1.3.1.4. Chọn File > Import > Import FASTA sequence từ các danh mục cơ sở dữ
liệu trên thanh công cụ.
5
1.3.2. Nhập dữ liệu trình tự dạng Chromatogram.
Asembler là một chương trình dịch hợp ngữ, cho phép lắp ráp các trình tự tiếp giáp nhau từ từng phần trình tự sau giải trình tự (sequencing experiments). Asembler chấp nhận tập tin chromatogram từ các máy giải trình tự tự động ABI, Beckman, Amersham. (ví dụ: Tập tin Chromatogram của virút Rubella thu nhận từ Beckman).
1.3.2.1. Vào Database > Add new entry, hoặc chọn trong cái thanh công cụ.
Đặt tên cho entry mới, trên cửa sổ của thư mục chủ sẽ hiển thị tên entry mới.
1.3.2.2. Ấn đúp chuột vào một mục của cơ sở dữ liệu mà chưa có trình tự. Cửa sổ Entry
Edit window xuất hiện.
1.3.2.3. Ấn để vào dạng trình tự. Ví dụ: Rubella VN.
1.3.2.4. Màn hình hiển thị “ The experiment “Rubella VN” is not defined for this entry. Do you want to create a new one?”
1.3.2.5. Ấn <Yes>, chương trình sẽ tạo một trình tự trống mới được kết nối với mục cơ
sở dữ liệu này.
Khi làm việc với Local database, Experiment card sẽđược mở. Ấn để đưa ra Assembler program.
Khi làm việc với trong các cơ sở dữ liệu đã kết nối (Connected database),
Sequence viewer sẽ được mở, ấn trên thanh công cụ để đưa ra Assembler program.
1.3.2.6. Ấn trong Experiment card hoặc Sequence viewer để đưa ra Assembler program. Cửa sổ Assembler window trống xuất hiện.
6 (Hình 1.3.2.7).
Hình 1.3.2.. Cửa sổ Assemble window.
1.3.2.8. Ấn vào biểu tượng trên thanh công cụ hoặc chọn File > Assembler sequence.
1.3.2.9. Chọn “Consensus trimming” hoặc ấn để mở hộp thoại Consensus trimming (Hình 1.3.2.8).
Hình 1.3.2.8. Hộp thoại Consensus trimming
Trong Trimming targets, điền vào Start pattern, Stop pattern, Mismatches, allowed, Taget range.
Ví dụ: Start pattern: CCAGTAG Start position offset: 0 Stop pattern: CGGGTC Stop position offset: 0
1.3.2.9. Sau đó lưu lại bằng cách chọn <Save> hoặc ấn .
7
1.3.3.1.1. Vào Database > Add new entry, hoặc chọn trên thanh công cụ Đặt tên cho entry mới, trên cửa sổ của thư mục chủ sẽ hiển thị tên entry mới.
1.3.3.1.2. Ấn vào tên entry mới trong thư mục chủ, cửa sổEntry Edit sẽ hiện lên.
1.3.3.1.3. Ấn vào hình trong cửa sổEntry Editđể nạp dữ liệu.
1.3.3.1.4. Cửa sổSequence Viewer sẽ hiện ra .
1.3.3.1.5. Sao chép dữ liệu từ clipboard vào cửa sổSequence Viewer. (Hình 1.3.2.1.5)
Ấn <Save> để lưu lại.
Hình 1.3.2.1.5. Cửa sổSequence Viewer
1.3.3.2. Nhập trình tự ADN trong Local database.
1.3.3.2.1. Chọn kiểu dữ liệu trình tựRubella VNđã tạo ra.
1.3.3.2.2. Ấn chuột phải vào File panel và chọn Add new experiment file từ bảng chọn di động. (Chú ý: Tính năng này chỉđược chấp nhận khi làm việc trên local database).
1.3.3.2..3. Nhập tên, ví dụ: “Seq01” và ấn <OK>.
1.3.3.2.4.. Chọn Seq01 trong Files panel, và File > Open experiment file (data). Điều này mở ra cửa sổ Sequence data file, mà ban đầu trống rống. Trước khi nhập
8
1.3.3.2.5. Chọn Entries > Add new entries hoặc ấn .
1.3.3.2.6.. Chương trình nhắc nhở việc nhập số của các mục; nhập 3 và ấn <OK>.
1.3.3.2.7. Sao chép một trình tự từ bảng ghi tạm của bộ nhớ máy tính (clipboard) và chọn Sequence > Paste from clipboard để dán nội dung của clipboard vào trình tựđược chọn lựa
1.3.3.2.8. Ấn chuột đúp hoặc chọn Sequence > Edit để chỉnh sửa bằng tay trình tự
hoặc thêm các bazơ.
1.3.3.2.9. Chọn File > Exit khi kết thúc công việc chỉnh sửa các trình tự.