Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2.1.3.Kết quả giải trình tự đoạn ADN đặc hiệu nucleoprotei nN virút sở
Đoạn gen ADN của các chủng virút sởi khuếch đại sau RT-PCR được tinh sạch theo quy trình sử dụng enzym ExoSAP-IP. Sản phẩm ADN tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2% đạt tiêu chuẩn cho quy trình giải trình tự tiếp theo. Sử
dụng hệ thống Beckman Counter để giải trình tự chuỗi nucleotit gen N virút sởi. Quy trình giải trình tự theo đúng quy trình chuẩn của Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử
(CHU Caen, Pháp). Hình 3.2.1.3 miêu tả một phần biểu đồ các đỉnh cường độ ánh sáng tương ứng với 4 màu huỳnh quang khác nhau đánh dấu 4 loại ddNTP. Trên biểu đồ
nhận thấy các đỉnh sóng sắc ký thu nhận sau giải trình tự tách biệt rõ ràng, có rất ít các
đoạn bị nhiễu do các đỉnh chồng chéo lên nhau. Kết quả thu nhận cho thấy quy trình tinh sạch ADN và giải trình tựđạt chuẩn hoá.
Hình 3.2.1.3. Một phần kết quả giải trình tự nucleotit genom N virút sởi bằng máy sequencer Beckman Counter
Sử dụng chương trình phần mềm BioNumerics (version 5.1) (Applied Maths, Bỉ) trên máy vi tính Dell Precision PWS670 hệ Window XP (version 2002, SP1) để xử
lý kết quả. Trình tự nucleotit đoạn ADN có kích thước từ 560bp-590bp của các mẫu phân tích được xác định. Kết quả so sánh bắt cặp giữa các trình tự, chúng tôi phát hiện có sựđột biến ở một vài vị trí bazơ trên trình tự ADN giữa các chủng sởi lưu hành tại các tỉnh miền Bắc năm 2006 với chủng lưu hành năm 2008. So sánh trình tự đoạn ADN giữa các chủng virút sởi trong các vụ dịch xảy ra tại các địa phương khác nhau trong cùng năm 2006 cũng phát hiện một vài điểm đột biến. Kết quả thu nhận cho phép xác định sự biến đổi về trình tự nucleotit của chủng virút sởi lưu hành tại miền Bắc VN. Đây có thể là một trong những căn nguyên gây bùng phát các vụ dịch sởi tại VN trong những năm gần đây.
Trình tự ADN chủng sởi phân lập từ các vụ dịch năm 2009 tại một số tỉnh miền Nam VN hầu như không có đột biến. Tỉ lệ tương đồng trong khoảng 99,6 - 100 % giữa trình tự các chủng này với chủng sởi Ninh Bình năm 2008. Điều này cho phép nhận
giải trình tự 02 chủng vắcxin sởi Ed-Vero, AIK-C Vero nhận thấy, các chủng này thuộc genotyp A, khác biệt với chủng lưu hành tại các vụ dịch ở VN. Điều này khớp với thông tin về nguồn chủng.
Các phương pháp xác định nhanh trình tự ADN được hoàn thiện vào cuối những năm 70. Cho đến nay, phương pháp giải trình tự nucleotit dựa trên phương pháp Sanger vẫn được công nhận là “tiêu chuẩn vàng”. Nó cho phép xác định chính xác trình tự
ADN các mẫu phân tích cũng như cung cấp những thông tin cấu trúc quan trọng. Các công bố cho thấy, phương pháp giải trình tự có ưu điểm nổi trội là cho biết được tuyệt
đối tất cả các thay đổi trong genom. Dựa trên sự so sánh bắt cặp giữa các trình tự
nucleotit, tính tương đồng cũng như các đột biến gen được xác định. Các kết quả thu nhận từ các công bố khoa học đều nhận định, việc xác định trình tự ADN genom là phần trung tâm của sinh học phân tử. [10], [27], [28]. Cùng với sự tiến bộ của kỹ thuật, hiện nay phương pháp giải trình tự được thực hiện tự động hoá. Tuy nhiên, để thực hiện được quy trình này đòi hỏi các trang thiết bị và sinh phẩm đặc biệt. Đây cũng là
điểm hạn chế của việc ứng dụng rộng rãi phương pháp giải trình tự trong điều kiện phòng thí nghiệm VN.
Theo WHO, đặc tính di truyền của virút sởi hoang dã cung cấp một phương tiện
để nghiên cứu đường lây truyền của virút và là một phần thiết yếu của giám sát phòng thí nghiệm bệnh sởi. Sự biến đổi trình tự nucleotit genom virút sởi là dữ liệu giá trị
trong Dịch tễ học phân tử. Kết quả thu nhận của chúng tôi bổ sung thêm thông tin cần thiết cho cơ sở dữ liệu vềđặc điểm di truyền của chủng virút sởi lưu hành tại VN trong những năm gần đây.
Bằng phương pháp giải trình tự, kết quả của công trình đã xác định được 16 trình tựđoạn gen ADN khoảng 522 bp - 590 bp thuộc gen N chủng virút sởi hoang dã lưu hành tại VN trong năm 2006-2009. Trình tự ADN thu được là nguồn cơ sở dữ
liệu cần thiết cho việc chọn lựa và ứng dụng các chương trình phần mềm Tin sinh học trong nghiên cứu Dịch tễ học phân tử.
(Ghi chú: Trình tự chuỗi nucleotit gen N của 16 chủng virút sởi phân tích được trình bày trong phần Phụ lục I - Sản phẩm Khoa học & Công nghệ)