II. RT-PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN ADN GEN E1 VIRÚT RUBELLA
2. Quy trình ứng dụng phần mềm “BioNumerics Fingerprint Types”
2.1. Tạo thư mục chủ:
Vào cửa sổ bắt đầu của chương trình BioNumerics, ấn Creat new databaseđể
tạo thư mục chủ. Đặt tên cho thư mục chủ. Ví dụ: Fingerprint MR.
2.2. Chọn kiểu dữ liệu Fingerprint trong thư mục chủ:
Vào BioNumerics main window, chọn Experiments > Create new fingerprint type từ bảng chọn, hoặc ấn vào nút trong Experiments panel toolbar và chọn
New fingerprint type.
2.2.1. Cửa sổ New fingerprint type sẽ nhắc việc nhập tên cho dạng mới (new type) Nhập tên, ví dụ "RFLP" và ấn <Next>
2.2.2. Chọn Two-dismensional TIFF files và 8 bit (256 values),ấn tiếp <Next>(Hình 2.2.2)
9
2.2.3. Trong bước tiếp theo, màn hình hiển thị: Do your fingerprints have inverted densitometric values? (Hình 2.2.3)
Chọn Yes để đồng ý đảo chiều từ bản gel gốc nền đen băng trắng sang nền trắng băng đen và ấn <Next>.
2.2.4. Chọn Yes để đồng ý Background subtration và ấn <Finish> để hoàn thành các bước tạo new fingerprint type.
Trong cửa sổ Experiments panel, tập tin RFLP được nạp vào danh mục như một dữ liệu fingerprint type.
2.3. Nhập dữ liệu Fingerprint vào kiểu dữ liệu đã chọn trong thư mục chủ.
2.3.1. Ấn nút trong Files panel hoặc chọn File > Add new experiment file trong
BioNumerics main window.
2.3.2. Chọn tập tin ảnh có đuôi TIFF từ thư mục chung, từđĩa hoặc từ trên website Ví dụ: chọn tập tin Gel_01.tif. (Hình 2.3.2)
2.3.3. Màn hình hiển thị: “Do you want to edit the image before adding it to the
database?” Ấn vào <Yes> để mở Image import window.
2.3.4. Trong Fingerprint Image import window chọn Image > Convert to gray scale > Averaged.
2.3.5. Tiếp theo, trong Fingerprint Image import window chọn File > Add image to database. Đóng cửa sổ Fingerprint image import, trở lại cửa sổ chính của thư
10
Open experiment file (data).
2.4.2. Cửa sổ Fingerprint data of (Gel_01) sẽ hiện lên. Chọn vùng mẫu phân tích trên bản gel (Hình 2.4.2)
Hình 2.3.2. Tập tin Gel_01.tif Hình 2.4.2. Tập tin Gel_01
2.4.3. Chọn Lanes > Auto search lanes hoặc ấn để chương trình tựđộng tìm kiếm các đường băng ADN. Nhập tổng số đường băng ADN tương ứng có trên bản gel vào hộp hội thoại Search lanes. Ví dụ: 18
2.4.4. Sử dụng con chuột máy tính và giữ phím Shirt để chỉnh các đường băng (Hình 2.3.9). Tiếp theo ấn <Next step>
11
khoảng cách dãn vào phần Averaging thickness. Ấn <Next step>
2.4.6. Chọn đểđánh dấu đường băng thang ADN chuẩn bằng cách ấn chuột vào vị
trí các thang. (Hình 2.4.6)
Hình 2.4.6. Đánh dấu đường băng thang ADN chuẩn.
2.4.7 Ấn chuột phải vào vị trí từng băng ADN trong thang chuẩn và chọn Add a new external reference positionđể nhập kích thước các băng ADN.(Hình 2.4.7) Sau khi nhập đủ kích thước tương ứng của các băng ADN chuẩn, ấn <Next step> .
12
Search on all lanes.
2.4.9. Dựa vào phần Densitometric curves phía bên phải cửa sổ Fingerprint data of (Gel_01) để chỉnh sửa và nâng cao chất lượng hình ảnh. Điều chỉnh ảnh nền, làm mịn đường cong và loại bỏ các băng nhiễu bằng cách nhấn chuột phải vào vị trí các băng này, chọn Delete select band(s), chương trình sẽ tựđộng xử lí. 2.4.10. Khôi phục lại băng xoá nhầm bằng cách nhấn chuột phải vào vị trí này và chọn
Add a new band.
2.4.11. Sau đó ấn hoặc <Save> để lưu các chỉnh sửa.
Các dữ liệu Fingerprint sau xử lí được nhập vào thư mục chủ của chương trình.
2.5. Nạp đường gel vào trong cơ sở dữ liệu.
2.5.1. Chọn vào Database > Add new entry hoặc chọn trên thanh công cụ. 2.5.2. Nhập tên của các mục cần tạo. Ví dụ: 1,2... và ấn <OK>
Phần mềm nhập tựđộng các mục dữ liệu với một từ khoá duy nhất.
2.5.3. Lựa chọn các tập tin gel trong File panel và File > Open experiment file (entries) trong bảng chọn hoặc ấn trên thanh công cụ của File panel.
Cửa sổ Fingerprint file ‘Gel_01’ sẽ được mở ra và liệt kê các đường băng ADN đã xác định (Hình 2.5.3).
13
2.5.4. Biểu tượng mũi tên liên kết cho mỗi một đường gel sẽ liên kết đường gel này vào trong cơ sở dữ liệu bằng cách di chuột.
Khi các thử nghiệm được liên kết, biểu tượng mũi tên sẽ chuyển sang màu tím. 2.5.5. Kéo mũi tên liên kết của đường 2 (đường 1 là một tham khảo) vào mục cơ sở dữ
liệu mới: ngay sau khi xong một mục cơ sở dữ liệu, hình dạng con trỏ thay đổi thành .
2.5.6. Thả chuột từ mục cơ sở dữ liệu đã tạo ra ở trên; mô hình 2 bây giờ đang liên kết với mục cơ sở dữ liệu đó và mũi tên liên kết của nó trong cửa sổ Fingerprint entry file trở thành màu tím thay vì màu xám .
Các đường gel đã được nạp vào các mục cơ sở dữ liệu của thư chủ.