6. Chuẩn Rubella dương tính 8 Thang ADN chuẩn 100bp
3.2.3.1.Kết quả multiplex PCR
Phương pháp multiplex PCR hiện đang được nhiều phòng thí nghiệm ứng dụng trong chẩn đoán bệnh bởi tính hiệu quả cao. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu có thể
khuếch đại đồng thời các đoạn ADN trong cùng một ống phản ứng. Do đặc tính kháng nguyên của virút sởi và Rubella đều gây sốt phát ban. Bằng chẩn đoán lâm sàng khó phân biệt được căn bệnh. Hiện nay, kỹ thuật ELISA xác định hiệu giá kháng thể IgM kháng đặc hiệu virút được sử dụng thường nhật trong chẩn đoán huyết thanh học bệnh sởi và Rubella [8]. Tuy nhiên, thực tế cho thấy, sự có mặt của các phản ứng chéo thường gây nên các dương tính giả, dẫn đến nhận định không chuẩn xác căn nguyên gây bệnh. Dựa trên nguyên lý chung của phương pháp RT-PCR, chúng tôi đã nghiên cứu và hoàn thiện một quy trình mới multiplex PCR, ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sởi và Rubella. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu Sar 1F và Sar 1Rchỉ cho phép khuếch
đại đoạn ADN 443 bp genom N virút sởi và cặp mồi Ru 1TR và Rube 1F chỉ khuếch
đại đoạn ADN 380 bp genom E1 virút Rubella cho thực hiện multiplex PCR. Theo nguyên tắc chung của multiplex PCR, các cặp mồi đặc hiệu được trộn chung với mẫu ARN virút và các thành phần tham gia phản ứng. Sau chu kỳ khuếch đại, sản phẩm ADN được kiểm tra trên gel agarose 2%. Kết quả quan sát trên điện di đồ Hình 3.2.3.1 thấy rõ 10 mẫu ADN trên đường gel 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 đều xuất hiện duy nhất một băng ADN kích thước khoảng 450 bp tương đương với kích thước băng ADN sởi của mẫu dương tính trên đường chạy số 13. Kích thước băng ADN các mẫu phân tích tách biệt với băng ADN 380 bp chuẩn Rubella dương tính được trộn chung trong mẫu số 13. Bằng phương pháp multiplex PCR, kết quả cho thấy 10 mẫu bệnh phẩm thu thập từ vụ dịch sởi tại miền Bắc VN năm 2006-2008 đều dương tính với sởi phù hợp với giám sát dịch tễ học.
Tương tự như vậy, 5 mẫu ADN phân lập từ vụ dịch nghi Rubella tại miền Nam VN được chẩn đoán xác định bằng phương pháp multiplex PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu cho virút sởi và Rubella như miêu tảở trên. Kết quảđiện di đồ thu nhận băng ADN có kích thước 380 bp đặc hiệu gen E1 Rubella. Kết quả xét nghiệm cho phép xác định chính xác virút Rubella là căn nguyên gây các vụ dịch tại một số địa phương miền Nam VN trong năm 2007.
1 2 3 4 5 6 7
Hình 3.2.3.1. Kết quả multiplex PCR xác định virút sởivà Rubella.
1,2. Mẫu ADN Rubella 3. Thang ADN chuẩn 100 bp
4,5. Mẫu ADN sởi 6. Mẫu chuẩn âm tính 7. Mẫu chuẩn dương tính
Phương pháp multiplex PCR cũng đã được nhiều tác giả nước ngoài sử dụng và công bố kết quả. Do nhu cầu ngày càng cao về kỹ thuật, multiplex PCR cho các khảo nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm sinh học và pháp y cũng như xét nghiệm chẩn đoán kiểu gen. Phương pháp multiplex PCR còn được sử dụng để phân tích bán định lượng biểu hiện gen bằng cách sửdụng các mẫu ADNc.[10], [11], [17]. Một số công trình ứng dụng multiplex PCR của các tác giả trong nước cho thấy hiện nay phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi trong các xác định phân typ các chủng virút và vi khuẩn gây bệnh. Phương pháp multiplex PCR ngày càng được công nhận bởi có nhiều ưu điểm như độ chính xác cao, tiết kiệm thời gian, giá thành giảm, thao tác đơn giản và kết quả rõ ràng [5], [21], [26].
Kết quả thu nhận của chúng tôi cũng phù hợp với nhận định của các tác giả
trong và ngoài nước. Quy trình kỹ thuật multiplex PCR được hoàn thiện và tối ưu hoá, phù hợp trong chẩn đoán phòng thí nghiệm virút sởi và Rubella.
3.2.3.2.Kết quả multiplex realtime PCR
Phương pháp realtime hiện được đánh giá là phương pháp sinh học phân tử hiện
đại, cho phép phát hiện và định lượng mẫu ADN. Chúng tôi đã xây dựng và hoàn chỉnh một phương pháp mới multiplex realtime PCR dựa trên sự kết hợp giữa hai phương pháp multiplex PCR và reattime PCR. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu virút sởi và Rubella cùng với sự tham gia của đoạn dò MVTaq đặc hiệu gen N virút sởi và đoạn dò RVP3 đặc hiệu cho gen E1 Rubella cho thực hiện phản ứng multiplex realtime PCR. Sản phẩm khuếch đại được phát hiện ở mỗi chu kỳ nhiệt bằng
cách dùng máy realtime PCR Smart Cycler đo tín hiệu huỳnh quang tức thời. Máy realtime giúp định lượng ADN có trong mẫu thử thông qua tín hiệu phát quang của chất huỳnh quang khi gắn kết với sợi đôi ADN được khuếch đại sau mỗi chu kỳ nhiệt.
(a) (b)
Kết quả định lượng ADN virút Rubella và virút sởi được miêu tả trên đồ thị
Hình 3.2.3.2a và Hình 3.2.3.2b tương ứng. Trục tung y biểu diễn giá trị ∆Rn của tín hiệu phát quang ở mỗi chu kỳ nhiệt, trục hoành x biểu diễn số chu kỳ phản ứng. Đồ thị
các đường cong biểu diễn lượng ADN khuếch đại trong mẫu thử có màu tương ứng với chất gắn huỳnh quang cho từng mẫu.
Quan sát các đường cong trên đồ thị Hình 3.2.3.2a nhận thấy 4/5 mẫu xét nghiệm dương tính với Rubella. Riêng mẫu A4 (đường mầu xanh lá cây) cho kết quả âm tính với Rubella khớp với kết quả RT-PCR ở trên. Sự có mặt của 10 đường cong với các mầu tương ứng của từng mẫu trên Hình 3.2.3.2.b cho thấy 10 mẫu xét nghiệm đều dương tính với virút sởi.
Bảng 3.2.3.2. Kết quả multiplex realtime PCR định lượng ADN virút sởi và Rubella.
Vị trí Mẫu ADN Rubella Cy3 Ct Sởi
FAM Ct Thường quy
A1 Rub 29 19.40 0.00 MULT sởi Rubella
A2 Rub2754 22.92 0.00 MULT sởi Rubella
A3 Rub 2781 23.66 0.00 MULT sởi Rubella (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A4 Rub Lan 0.00 37.03 MULT sởi Rubella
A5 Rub 11 24.47 0.00 MULT sởi Rubella
A6 VAC J AIK 0.00 21.27 MULT sởi Rubella
A7 MR 193 0.00 16.71 MULT sởi Rubella
A8 VACJ AIK-Vero 0.00 20.30 MULT sởi Rubella
A9 LAO 0.00 38.25 MULT sởi Rubella
A10 LAO 0.00 37.42 MULT sởi Rubella
A11 MR 09/09 0.00 18.70 MULT sởi Rubella
A12 MR 119 0.00 20.24 MULT sởi Rubella
A13 MR 161 0.00 17.51 MULT sởi Rubella
A14 Chứng (-) 0.00 0.00 MULT sởi Rubella
A15 Chứng (+) sởi 0.00 22.50 MULT sởi Rubella
A16 Chứng (+) Rubella 25.93 0.00 MULT sởi Rubella
Kết quảđịnh lượng ADN các mẫu xét nghiệm được thống kê trên Bảng 3.2.3.2. Dựa trên giá trị định lượng có thể chẩn đoán chính xác mẫu bệnh phẩm nhiễm
sởi/Rubella. Kết quả thu nhận cho thấy phương pháp multiplex realtime PCR tỏ ra hữu ích trong chẩn đoán những trường hợp nghi ngờ giữa sởi/Rubella. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy phương pháp này còn đạt hiệu quả trong xét nghiệm mẫu có mặt của nhiều tác nhân gây bệnh và đặc biệt là những mẫu có hàm lượng ADN thấp thông thường không phát hiện được bằng PCR [7], [10], [25]. Tuy nhiên để thực hiện
được phương pháp này cần phải trang bị máy realtime PCR và sinh phẩm đắt tiền. Do vậy phương pháp chỉ thực hiện được ở những phòng thí nghiệm có đủđiều kiện.
Điểm nổi bật của công trình nghiên cứu này là phương pháp mới multiplex realtime PCR sử dụng các đoạn dò gắn huỳnh quang thiết kế đặc hiệu cho xác định ADN sởi và Rubella đã được xây dựng và lần đầu tiên ứng dụng trong chẩn đoán bệnh.