1.1 Tách chiết ARN virút sởi
Toàn bộ ARN virút được tách chiết từ 280 µl dịch nuôi cấy tế bào Vero SLAM gây nhiễm chủng virút sởi. Sử dụng Kit QIAamp Viral RNA Isolation (QIAgen, Mỹ) cho công đoạn tách chiết. Quy trình tách chiết theo đúng thường quy đi kèm của bộ Kit.
4
theo Bảng 1, trừ mẫu ARN. Tính tổng số phản ứng cần thực hiện (gồm cả mẫu chuẩn dương tính và âm tính). Chuẩn bị một thể tích hỗn dịch cần thiết lớn hơn 10% so với tổng số lượng các phản ứng.
Bảng 1. Thành phần phản ứng cho RT-PCR
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích/phản ứng
Dung dịch đệm (Reaction Mix -Invitrogen) 2X 12,5 µl
Mồi xuôi (n1) 10 µM 1,5 µl
Mồi ngược (n2R) 10 µM 1,5 µl
Enzyme RT / Platinum Taq Mix Invitrogen 5 U/ µl 0,5 µl
Nước cất vô trùng (RNase-free) 6,5 µl
Mẫu ARN phân tích 10 - 100 ng/ µl 2,5 µl
Tổng thể tích 25µl
1.3. Trộn hỗn dịch và phân chia lượng thích hợp vào ống PCR.
Trộn kỹ hỗn dịch bằng cách hút lên và xuống nhẹ nhàng một vài lần bằng pipet. Phân chia thể tích hỗn dịch đã chuẩn bị theo cách trên vào các ống PCR (22,5 µl/ ống).
1.4. Thêm mẫu ARN vào từng ống PCR.
Thêm 2,5 µl mẫu ARN virút sởi vào từng ống PCR đã chứa 22.5 µl hỗn dịch ở trên. Tổng thể tích cuối cùng cho mỗi ống PCR đạt 25 µl.
1.5. Thực hiện phản ứng RT-PCR
- Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR được cài đặt trên máy chạy PCR theo Bảng 2
Bảng 2. Điều kiện chu kỳ nhiệt Phiên mã ngược (RT) 55°C 30 phút Khởi đầu PCR 94°C 4 phút Chu kỳ thứ nhất: 10 chu kỳ 95°C 30 giây 57°C 30 giây 72°C 1 phút
Chu kì thứ hai 25 chu kỳ + 5 giây/ chu kỳ
95°C 30 giây
57°C 30 giây
72°C 1 phút
Kết thúc 72°C 10 phút
4°C ∞
- Đặt các ống PCR gồm đủ các thành phần phản ứng vào máy PCR. Khởi động chương trình RT-PCR đã được cài đặt.
1.6. Bảo quản sản phẩm ADN sau RT-PCR
5
- Nhỏ mẫu: trộn 5µl sản phẩm ADN với 2µl Blue Bromophenol. Nhỏ 7 µl mẫu/giếng của bản gel agarose 2%.
- Đặt bản gel trong bểđiện di. Điện di: 150 V/30 phút.
- Nhuộm gel: ngâm bản gel trong đệm TBE 1X + edithium bromid 30 phút. - Chụp ảnh bản gel trênmáy gel doc (hoặc máy chụp Polaroid)
- Kiểm tra kích thước các đoạn ADN được khuếch đại bởi RT-PCR trên bản gel.
KẾT QUẢ MINH HOẠ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm ADN virút sởi sau RT-PCR
1.2.3.4.5.6.7.8.10.11. Mẫu ADN virút sởi 9. Thang ADN chuẩn 100bp 9. Thang ADN chuẩn 100bp
12. Chuẩn âm tính 13. Chuẩn dương tính