Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2.1.1. Tách chiết ARN virút sở
Chủng virút sởi có nguồn gốc từ mẫu bệnh phẩm dịch họng hầu được gây nhiễm và tăng sinh trên nuôi cấy tế bào thường trực Vero SLAM. Virút sởi thông thường
được phân lập từ bệnh phẩm ngay giai đoạn tiên phát đến vài ngày sau khi phát ban. Sự
nhân lên của virút trên tế bào gây nhiễm với việc tạo các đám tế bào liên hợp được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Hình ảnh các virút sởi giải phóng từ tế bào được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử cho thấy, các hạt virút có cấu trúc hình cầu kích thước 200-250 nm điển hình của virút sởi (Hình 3.2.1.1). Các mẫu tế bào dương tính sau gây nhiễm được chọn làm nguồn chủng cho tách chiết ARN virút. Quy trình gây
nhiễm và tăng sinh virút đóng vai trò quan trọng vì kết quả của các công đoạn tiếp theo của nghiên cứu phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của vật liệu virút ban đầu.
Hình 3.2.1.1. Hạt virút sởi tách từ tế bào Vero SLAM
(Phòng Kính hiểnvi điện tử Viện VSDTTƯ -2008)
Toàn bộ ARN virút sởi được tách chiết từ 280 µl dịch tế bào Vero SLAM gây nhiễm cho hiệu xuất tinh sạch cao. Quy trình tách chiết ARN của chúng tôi có bước cải tiến mới. Ở giai đoạn cuối cùng, ARN được giữ nguyên trên cột và bảo quản ở -200C cho đến khi thực hiện các kỹ thuật tiếp theo. Cách bảo quản ARN trên cột giữ cho sản phẩm không bị biến tính và an toàn cho việc vận chuyển mẫu ARN.
Theo khuyến cáo của WHO cũng như các công bố khoa học của các tác giả
trong và ngoài nước, nuôi cấy tế bào thường trực Vero SLAM được lựa chọn là dòng tế
bào thích hợp nhất cho việc gây nhiễm và phân lập chủng virút sởi. [11], [27], [28].Kết quả thunhận của chúng tôi cũng cho thấy, so với dòng tế bào B95a, tế bào Vero SLAM tỏ ra thuận tiện và đặc hiệu hơn cho việc gây nhiễm và tăng sinh chủng virút sởi.
3.2.1.2. Kết quả RT-PCR và Nested PCR nhân đoạn gen Nucleocapsit Nvirút sởi
+ Kết quả RT-PCR
RT-PCR là một trong các phương pháp sinh học phân tửđược áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh sởi. Các nghiên cứu đều tập trung phân tích đoạn ADN dài khoảng 500 nucleotit đầu tận cùng –COOH của genom Nucleocapsit N virút sởi. Trong nghiên cứu này, 30 mẫu ARN virút sởi tinh sạch từ các nuôi cấy tế bào Vero SLAM gây nhiễm chủng sởi được sử dụng cho phản ứng RT-PCR. Đoạn ADN đặc hiệu nucleocapsit N virút sởi được tổng hợp từ ARN bởi enzym phiên mã ngược Superscript
II RT và các thành phần của bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR. Sản phẩm ADN khuếch
đại sau RT- PCR được kiểm tra trên gel agarose 2% nhuộm với edithium bromit. Kết quảđiện di trên Hình 3.2.1.2a thu nhận một băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 587 bp, phù hợp với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hình 3.2.1.2a. Ảnh điện di sản phẩm ADN virút sởi sau RT-PCR
1.2.3.4.5.6.7.8.10.11. Mẫu ADN virút sởi 12. Chuẩn âm tính 9. Thang ADN chuẩn 100bp 13. Chuẩn dương tính
Cho đến nay, RT-PCR đã trở thành kỹ thuật thường nhật được thực hiện tại hầu hết các phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh sởi trong và ngoài nước. Tuy nhiên, tuỳ theo mục đích nghiên cứu của từng công trình thực nghiệm, trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho khuếch đại đoạn gen N virút sởi có thểđược thiết kế khác nhau. Chu kỳ phản ứng RT-PCR cũng được thiết kế phù hợp với từng nghiên cứu. Điểm chung nhất là các
đoạn ADN được khuếch đại đều tập trung trong vùng 500- 590 bp. [1], [10], [13], [17]. So với các công trình khoa học đã công bố, quy trình thực hiện phản ứng RT- PCR của chúng tôi có điểm khác biệt. Giai đoạn thực hiện phản ứng nhiệt gồm 35 chu kỳ, được lập trình với 2 công đoạn. Công đoạn thứ nhất gồm 10 chu kỳ [95°C/30 giây, 57°C/30 giây, 72°C/1 phút], công đoạn tiếp theo kéo dài 25 chu kỳ [95°C/30 giây, 57°C/30 giây, 72°C/1 phút] + 5 giây cho mỗi chu kỳ. Với việc bổ sung thêm thời gian như trên, quá trình khuếch đại đoạn ADN đạt hiệu xuất cao hơn. Điểm mới này giúp cho việc tối ưu hoá quy trình kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu.
+ Kết quả Nested PCR
Với các chủng virút không xác định được băng ADN sau RT-PCR, cần tiến hành tiếp phản ứng Nested PCR. Phản ứng Nested PCR làm tăng độ nhạy và tính đặc
hiệu của phản ứng PCR thứ nhất bằng cách nhân lên đoạn ADN bên trong vùng khuếch
đại. Với các cặp mồi đặc hiệu, đoạn ADN đặc hiệu gen N virút sởi có kích thước 576bp
được tổng hợp. Kết quảđược quan sát trên Hình 3.2.1.2b.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.2.1.2b. Ảnh điện di sản phẩm ADN virút sởi sau Nested PCR 1. Chuẩn dương tính 2.Chuẩn âm tính
3.4.5.6.7.8.9. Mẫu ADN virút sởi 10. Thang ADN chuẩn 100bp
Tương tự như quy trình RT-PCR, chu kỳ phản ứng nhiệt của Nested PCR được thực hiện 2 bước. Bước thứ nhất gồm 10 chu kỳ [95°C/30 giây, 57°C/30 giây, 72°C/1 phút] và bước thứ 2 gồm 25 chu kỳ [95°C/30 giây, 57°C/30 giây, 72°C/1 phút] cộng thêm 5 giây cho mỗi chu kỳ. Sản phẩm ADN thu được sau Nested PCR đảm bảo tiêu chuẩn về nồng độ và chất lượng cho việc phân tích ADN tiếp theo. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với một số công trình của các tác giả nước ngoài đã công bố. Kích thước của các đoạn ADN bên trong vùng khuếch đại khoảng từ 492- 576bp. [10], [17], [21]. Điều này cho phép đánh giá, quy trình được xây dựng đạt chuẩn hoá và có giá trị ứng dụng trong phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh sởi.