số thuốc kháng sinh
Thực tế tại nhiều nước, việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo chỉ dẫn đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phát triển, gây khó khăn trong công tác điều trị lâm sàng trong nhân y cũng như trong thú y. Trong lâm sàng, để lựa chọn thuốc điều trị thích hợp là không dễ dàng. Một trong những hướng lựa chọn thuốc là xét nghiệm xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh với một số thuốc kháng sinh hay còn gọi là kỹ thuật kháng sinh đồ.
Kháng sinh đồ là kỹ thuật tìm hiểu và đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với loại kháng sinh, qua đó định hướng cho thầy thuốc sử dụng kháng sinh một cách khoa học, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế hiện tượng nhờn thuốc, kháng thuốc của vi khuẩn.
Có nhiều cách để đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh như phương pháp đặt ống trụ, khuếch tán trên thạch… Theo Nguyễn Xuân Thành và cs. (2005), phổ biến nhất là kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán dựa theo nguyên lý của Kirby-Bauer. Ưu điểm của kỹ thuật này là có thể cùng một lúc thử tác dụng của nhiều loại kháng sinh trên cùng một loại vi khuẩn. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý khuếch tán kháng sinh từ khoanh giấy vào môi trường thạch. Mức độ khuếch tán phụ thuộc vào phân tử lượng của từng loại kháng sinh và vào độ dày của thạch trên đĩa Petri. Do đó, nồng độ kháng sinh càng gần quanh khoanh giấy thì càng cao, càng xa khoanh giấy càng thấp. Những vùng xung quanh khoanh giấy là vùng ức chế. Đường kính của vòng vô khuẩn càng lớn thì chứng tỏ khả năng mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh đó càng cao, vi khuẩn đó nhạy cảm với kháng sinh. Ngược lại, nếu đường kính nhỏ hay vi khuẩn mọc sát vào mép khoanh giấy chứng tỏ vi khuẩn đó không nhạy cảm (kháng) với kháng sinh tẩm trong giấy.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Đối tượng: các mẫu thịt lợn thu thập được tại một số chợ trên địa bàn huyện Luangprabang, tỉnh Luangprabang , Lào.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn Thú y cộng đồng – Khoa thú y - Học viện nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2019.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra tình trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn trên địa bàn huyện Luangprabang, tỉnh Luangprabang – Lào .
- Phân tích yếu tố nguy cơ làm ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli
và Salmonella trong thịt lợn.
- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella trong các mẫu thịt lợn thu thập được tại một số chợ thuộc huyện Luangprabang, tỉnh luangprabang - Lào.
- Xác định mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E.coli và
Salmonella phân lập được trên các mẫu thịt lợn.
3.4. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.4.1. Vật liệu nghiên cứu 3.4.1. Vật liệu nghiên cứu
3.4.1.1. Môi trường phân lập vi khuẩn E.coli
Nghiên cứu này sử dụng các môi trường chọn lọc và thuốc thử các phản ứng sinh học của vi khuẩn E.coli bao gồm: môi trường thạch Brilliant Green, MacConkey agar, Eosin Methyl Blule, Simmons Citrate, thuốc thử Kovac’s, thuốc thử methyl red.
3.4.1.2. Môi trường phân lập vi khuẩn Salmonella
Các môi trường tăng sinh, môi trường chọn lọc dùng phân lập vi khuẩn Salmonella từ thịt lợn được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW), canh thang Rappaport – Vassiliadis Soya Pepton (RV), Muller Kauffman Tetrathionate (MKTTn), Brain heart broth (BHB), Xyloze – Lyzine – Tergitol 4 (XLT ), Brilliant Green Agar (BGA), Triple Sugar
Iron Agar (TSI), thuốc thử Kovac’s/Indol bao gồm: Catalase, Oxidase, Kít nhuộm gram (Merck).
+ Môi trường kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella: Glucose, Manitol, Lactose, Sorbitol, Dextrose, Sucrose, Galactose, Arabinose.
3.4.1.3. Môi trường, hóa chất làm kháng sinh đồ
Khoanh giấy tẩm kháng sinh: Ampicillin, Amoxicillin, Colistin, Doxycycline, Gentamycine, Kanamycin, Neomycin, Streptomycin, Sulfamethoxazole, Tetracycline. Nghiên cứu này sử dụng môi trường thạch Muller - Hinton agar và nước muối sinh lý 0,85%.
3.4.2. Trang thiết bị, dụng cụ
3.4.2.1.Trang thiết bị
Nghiên cứu này sử dụng các thiết bị thường dùng trong nghiên cứu vi sinh vật, bao gồm: Nồi hấp, tủ ấm, thiết bị đồng nhất mẫu Stomacher, máy li tâm (3000 v/ph), buồng cấy vi sinh vật, thiết bị đo pH, máy đếm khuẩn lạc, máy trộn Vortex.
3.4.2.2. Dụng cụ
Một số dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, cốc đong, ống đong, phễu lọc, micropipette, đèn cồn, que cấy, túi đựng mẫu, thước đo vòng vô khuẩn…Tất cả các dụng cụ, hóa chất, môi trường nuôi cấy, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn đều phải vô trùng tuyệt đối trước khi sử dụng.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp điều tra 3.5.1. Phương pháp điều tra
Tiến hành điều tra hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh tại các trang trại chăn nuôi, hộ chăn nuôi lợn bằng hình thức phỏng vấn trực tiếp chủ chăn nuôi.
3.5.2. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán thịt tại một số chợ thuộc huyện Luangprabang, tỉnh Luangprabang - Lào. Lấy mẫu theo TCVN. (TCVN 4833 - 1:2002); (TCVN 4833 - 2:2002).
Thịt và sản phẩm của thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thịt được lấy tại các quầy bán thịt vào buổi sáng sớm. Tại mỗi chợ, mẫu được thu thập ngẫu nhiên từ 5 quầy, mỗi quầy lấy ngẫu nhiên 04 vị trí sao cho tổng trọng lượng
mẫu khoảng từ 25 - 50g, cho vào túi đựng mẫu vô trùng hoặc đựng trong túi dùng để pha loãng và đồng nhất mẫu. Mẫu sau khi lấy phải bảo quản lạnh 0 đến 2 ºC và được vận chuyển về phòng thí nghiệm.
3.5.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella3.5.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli 3.5.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli
Theo phương pháp phân lập vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tuân theo kỹ thuật phát hiện và định lượng E.coli dựa trên Kĩ thuật đếm số có xác suất lớn nhất 6846 : 2007 (ISO 7251 : 2005).
Chuẩn bị mẫu: Đối với thịt để đông lạnh, phải rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng cho đến khi đạt 13-15oC. Dùng kéo và panh vô trùng cắt thịt thành những miếng nhỏ. Cân 25g thịt đã cắt nhỏ, cho vào túi đựng mẫu, cho vào thêm 225ml nước sinh lý. Sử dụng máy dập mẫu để đồng nhất mẫu trong thời gian khoảng 2 phút (chọn tốc độ 230rpm). Tiếp tục pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân (10 -2 , 10 -3 , 10 -4 …)
Cấy và ủ vào môi trường canh thang Brilliant Green : Sử dụng phương pháp 9 ống, mỗi ống có 10ml môi trường và 1 ống Durham. Chọn 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng cấy 1ml vào 3 ống môi trường. Lắc nhẹ ống môi trường để ống Durham chìm xuống, không có bọt khí trong ống Durham.
Đem toàn bộ 9 ống ủ ở 37 oC trong 48 giờ, sau đó lấy ra đọc kết quả: Ống dương tính là những ống có sinh hơi, ống Durham nổi lên, môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng nhạt.
Từ các ống dương tính ria cấy sang môi trường thạch đĩa MacConkey, EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC/24h. Trên môi trường MacConkey: khuẩn lạc E.coli
có màu hồng cánh sen, tròn gọn; EMB: khuẩn lạc tròn, dẹt, có ánh kim tím. Tiến hành thử nghiệm IMViC:
+ Phản ứng sinh Indole: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone. Ủ ở 37 oC trong 24 – 48 giờ. Nhỏ 1ml thuốc thử Kovac’s vào ống môi trường. Phản ứng (+) lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu đỏ.
+ Phản ứng với đỏ methyl (Methyl red): Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37 oC trong 2 – 4 ngày. Nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl vào ống môi trường. Phản ứng (+) màu đỏ.
glucose. Ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chuyển 1ml canh trùng sang 1 ống nghiệm khác. Nhỏ vào 0,6ml dung dịch cồn α-naptol, 0,2ml dung dịch Kalihydroxide 40%, lắc đều. Đọc kết quả sau 5 – 15 phút: Phản ứng (+): màu dỏ.
+ Trên môi trường thạch Simmons Citrate: Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng. Ủ ở 37oC trong 1 – 3 ngày. E.coli không mọc trên môi trường
Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chính là E.coli. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.
Đọc kết quả
Xác định số ống dương tính ở mỗi độ pha loãng, từ đó tra bảng MPN thích hợp, tính kết quả theo công thức sau:
3.5.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch (TCVN 4829 : 2005), (ISO 6579 : 2002).
+ Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ.
+ Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1 ml sang ống chứa 10 ml môi trường tăng sinh Rappaport - Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến 42oC, sau đó ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.
Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh thu được vào ống chứa 10ml Muller Kauffmann tetrathionat ủ ở 37oC trong 24 giờ.
+ Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport - Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi trường BGA, ủ 37oC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đỏ hồng, tròn bóng,
MPN/g hay MPN/ml= (MPN/g hay ml trong bảng ÷ 100) x số lần pha loãng mẫu của nồng độ ở giữa
lồi trên mặt thạch.
Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLT4, ủ 37oC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
+ Bước 4: Khẳng định
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong các môi trường trên vì thế phần thạch nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella
đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Vi khuẩn sinh hơi môi trường bị đẩy lên tạo một khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường Tryptophan. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac’s, nếu xuất hiện vòng màu đỏ - phản ứng dương tính, nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng – phản ứng âm tính.
Phản ứng thử Oxydase: tiến hành trên giấy được tẩm dung dịch Oxidase (Remel). Dùng que cấy vô trùng cấy khuẩn lạc từ môi trường thạch dàn đều trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen (giấy đổi màu có thể màu xanh) sau 10 giây là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu tím đen hay giấy không đổi màu là phản ứng âm tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính, nếu không thấy sủi bọt là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng Catalase dương tính.
3.5.4. Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng
E.coli và Salmonella phân lập được
Phương pháp Bauer - Kirby dùng để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn mô tả bởi Carter và Cole năm 1990 được sử dụng trong thí nghiệm này. Đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả của M100-S24 theo Wayne P. (2014),. Vi
khuẩn phân lập được từ các mẫu phân tích cấy sang môi trường thạch nghiêng NA (Nutrient agar), để 37ºC/24 giờ. Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào 9 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều và điều chỉnh để có độ đục Mc Farland 0,5. Sau đó chuyển canh khuẩn dàn đều trên bề mặt đĩa thạch Muller – Hinton (MH). Đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch, mỗi đĩa thạch đặt 5 – 6 khoanh giấy tẩm kháng sinh. Nuôi ở nhiệt độ 37ºC trong khoảng thời gian 18 – 24 giờ.
Các bước tiến hành như sau:
+ Bước 1: chuẩn bị môi trường thạch Muller – Hinton.
+ Bước 2: các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller – Hinton.
+ Bước 3: giấy tẩm kháng sinh được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa. + Bước 4: nuôi dưỡng ở 37ºC trong 18 – 24 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá mức độ nhảy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn để xác định tính mẫn cảm hay đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn
STT Tên kháng sinh Ký hiệu mã hóa Lượng kháng sinh (µg) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) R () I H (≥) 1 Amoxicilin Am 10 13 14-16 17 2 Ampicillin Am 10 13 14-16 17 3 Doxycycline Dx 30 10 11-13 14 4 Gentamycin Ge 10 12 13-14 15 5 Kanamycin Kn 30 13 14-17 18 6 Streptomycin Sm 10 11 12-14 15 7 Tetracycline Te 30 11 12-14 15
Ghi chú: H (high): mẫn cảm cao I (Intermediate): mẫn cảm trung bình
R (Resistant): Kháng (M100-S24: Tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh tiêu chuẩn)
Các loại kháng sinh được chọn để kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn E.coli và Salmonella trong nghiên cứu này dựa theo tiêu chuẩn của Quốc
tế về danh mục kháng sinh cần kiểm soát đối với vi khuẩn kháng thuốc.
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010.
• Số trung bình: = Trong đó: : Số trung bình
x
i: Số hạng thứ i n: Dung lượng mẫu
• Độ lệch chuẩn: S
x =
• Sai số trung bình: = (Với n 30) = (Với n < 30)
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH TRẠNG SỬ DỤNG KHÁNG SINH, PHƯƠNG THỨC GIẾT MỔ, VẬN CHUYỂN VÀ BÀY BÁN THỊT LỢN TRÊN PHƯƠNG THỨC GIẾT MỔ, VẬN CHUYỂN VÀ BÀY BÁN THỊT LỢN TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN LUANGPRABANG,TỈNH LUANGPRABANG, LÀO
4.1.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn trên địa bàn huyện Luangprabang, tỉnh Luangprabang, Lào Luangprabang, tỉnh Luangprabang, Lào
Kết quả điều tra tình hình sử dụng các loại kháng sinh trên địa bàn huyện Luangprabang, tỉnh Luangprabang, Lào được trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tình hình sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi lợn tại địa bàn huyện Luangprabang, tỉnh Luangprabang, Lào.
TT Tên kháng sinh Số Hộ/Gia/Trang trại
(n=259) Tỷ lệ (%) 1 Amoxicilin 40 15,44 2 Ampicillin 45 17,37 3 Doxycycline 20 7,72 4 Kanamycin 28 10,81 5 Gentamycin 33 12,74 6 Streptomycin 55 21,23 7 Tetracycline 38 14,67
Phần lớn các cơ sở chăn nuôi đều biết hoặc nghe thấy khái niệm “Nhờn thuốc” trong chăn nuôi. Nhưng, theo các chủ hộ trong quá trình điều trị con vật bị bệnh, nếu dùng thuốc này không khỏi thì họ tự động thay đổi thuốc theo kinh nghiệm cá nhân hoặc theo tư vấn từ các bác sĩ thú y, thú y viên hoặc theo các công ty về thuốc tư vấn mà không hiểu về cơ chế và tác hại của nó. Đây là một nguyên nhân quan trọng dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh ngày càng lan rộng.
Kết quả điều tra cũng cho thấy: tại các hộ chăn nuôi lợn nhỏ lẻ tại địa phương thì khi con vật bị bệnh thường tự ý dùng kháng sinh để điều trị chứ không lấy mẫu gửi về các phòng thí nghiệm để xét nghiệm và tìm ra kháng sinh còn mẫn cảm với mầm bệnh để có phác đồ điều trị hiệu quả. Chỉ có một số trang trại vừa và nhỏ, do có sự hỗ trợ của các công ty thuốc hoặc cám nên khi con vật bị bệnh họ có lấy mẫu
gửi đi xét nghiệm nhưng thời gian chờ đợi lâu nên họ sử dụng các loại kháng sinh hiện có để điều trị tạm thời.
Như vậy, với việc sử dụng kháng sinh tràn lan như hiện nay cùng với sự quản