Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5.3.Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3.Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella
3.5.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli
Theo phương pháp phân lập vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tuân theo kỹ thuật phát hiện và định lượng E.coli dựa trên Kĩ thuật đếm số có xác suất lớn nhất 6846 : 2007 (ISO 7251 : 2005).
Chuẩn bị mẫu: Đối với thịt để đông lạnh, phải rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng cho đến khi đạt 13-15oC. Dùng kéo và panh vô trùng cắt thịt thành những miếng nhỏ. Cân 25g thịt đã cắt nhỏ, cho vào túi đựng mẫu, cho vào thêm 225ml nước sinh lý. Sử dụng máy dập mẫu để đồng nhất mẫu trong thời gian khoảng 2 phút (chọn tốc độ 230rpm). Tiếp tục pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân (10 -2 , 10 -3 , 10 -4 …)
Cấy và ủ vào môi trường canh thang Brilliant Green : Sử dụng phương pháp 9 ống, mỗi ống có 10ml mơi trường và 1 ống Durham. Chọn 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng cấy 1ml vào 3 ống môi trường. Lắc nhẹ ống môi trường để ống Durham chìm xuống, khơng có bọt khí trong ống Durham.
Đem toàn bộ 9 ống ủ ở 37 oC trong 48 giờ, sau đó lấy ra đọc kết quả: Ống dương tính là những ống có sinh hơi, ống Durham nổi lên, mơi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng nhạt.
Từ các ống dương tính ria cấy sang mơi trường thạch đĩa MacConkey, EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC/24h. Trên môi trường MacConkey: khuẩn lạc E.coli có màu hồng cánh sen, trịn gọn; EMB: khuẩn lạc trịn, dẹt, có ánh kim tím.
Tiến hành thử nghiệm IMViC:
+ Phản ứng sinh Indole: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone. Ủ ở 37 oC trong 24 – 48 giờ. Nhỏ 1ml thuốc thử Kovac’s vào ống môi trường. Phản ứng (+) lớp thuốc thử trên mặt mơi trường có màu đỏ.
+ Phản ứng với đỏ methyl (Methyl red): Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone glucose. Ủ ở 37 oC trong 2 – 4 ngày. Nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl vào ống môi trường. Phản ứng (+) màu đỏ.
glucose. Ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chuyển 1ml canh trùng sang 1 ống nghiệm khác. Nhỏ vào 0,6ml dung dịch cồn α-naptol, 0,2ml dung dịch Kalihydroxide 40%, lắc đều. Đọc kết quả sau 5 – 15 phút: Phản ứng (+): màu dỏ.
+ Trên môi trường thạch Simmons Citrate: Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng. Ủ ở 37oC trong 1 – 3 ngày. E.coli không mọc trên môi trường
Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chính là E.coli. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha
loãng của mẫu. Đọc kết quả
Xác định số ống dương tính ở mỗi độ pha lỗng, từ đó tra bảng MPN thích hợp, tính kết quả theo cơng thức sau:
3.5.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch (TCVN 4829 : 2005), (ISO 6579 : 2002).
+ Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ.
+ Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1 ml sang ống chứa 10 ml môi trường tăng sinh Rappaport - Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến 42oC, sau đó ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.
Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh thu được vào ống chứa 10ml Muller Kauffmann tetrathionat ủ ở 37oC trong 24 giờ.
+ Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport - Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi trường BGA, ủ 37oC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đỏ hồng, trịn bóng,
MPN/g hay MPN/ml= (MPN/g hay ml trong bảng ÷ 100) x số lần pha lỗng mẫu của nồng độ ở giữa
lồi trên mặt thạch.
Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLT4, ủ 37oC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đen, trịn bóng, lồi trên mặt thạch.
+ Bước 4: Khẳng định
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong các mơi trường trên vì thế phần thạch nghiêng của mơi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dịng Salmonella
đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Vi khuẩn sinh hơi môi trường bị đẩy lên tạo một khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường
Tryptophan. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac’s, nếu xuất hiện vòng màu đỏ - phản ứng dương tính, nếu xuất hiện vịng màu nâu vàng – phản ứng âm tính.
Phản ứng thử Oxydase: tiến hành trên giấy được tẩm dung dịch Oxidase
(Remel). Dùng que cấy vô trùng cấy khuẩn lạc từ môi trường thạch dàn đều trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen (giấy đổi màu có thể màu xanh) sau 10 giây là phản ứng dương tính. Nếu khơng xuất hiện màu tím đen hay giấy khơng đổi màu là phản ứng âm tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường
thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính, nếu khơng thấy sủi bọt là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng Catalase dương tính.