3.5.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
Việc lấy mẫu được tiến hành theo TCVN 4833-1:2002:
Mẫu ban đầu: Đối với một lô hàng ta lấy ngẫu nhiên 3 - 5 sản phẩm tại các vị trí khác nhau trong kho bảo quản sao cho các vị trí được lấy mẫu được phân bổ đều và đại diện cho lô hàng để lập thành mẫu ban đầu. Mẫu lấy về cần được thử nghiệm ngay càng sớm càng tốt. Nếu không đủ điều kiện để tiến hành thử nghiệm ngay thì bảo quản mẫu ở điều kiện giống như điều kiện tại kho bảo quản sản phẩm (–180C).
Mẫu chung: Mỗi sản phẩm trong mẫu ban đầu lấy tại các vị trí khác nhau, gộp lại thành 1 mẫu chung.
Lập mẫu trung bình: Tiến hành trộn các mẫu chung và rút ra mẫu trung bình để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh.
Việc lấy mẫu thử nghiệm được thực hiện tại phòng xử lý mẫu vô trùng của trạm Chẩn đoán Xét nghiệm. Mẫu được phân chia với tỷ lệ như sau: 1/4 dùng cho các chỉ tiêu cảm quan; 1/4 dùng cho các chỉ tiêu vi sinh vật; 1/4 dùng cho các chỉ tiêu lý hóa; và 1/4 để lưu mẫu. Sau khi xử lý, mẫu được đưa đến các phòng thí nghiệm liên quan.
Chuẩn bị mẫu để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh:
Cân vô trùng 50g mẫu thử, chính xác đến 0,1g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn tốc độ cao. (Đối với mẫu đông lạnh, cân mẫu chưa rã đông. Ổn định mẫu thử đông lạnh ở 20C đến 50C trong thời gian không quá 18h để lấy 50g phần mẫu thử, nếu cần). Thêm 450 ml nước dùng để pha loãng và trộn trong 2 phút. Thời gian trộn mẫu thử đến khi cấy mẫu lên đĩa môi trường không được quá 15 phút.
Nếu tổng khối lượng mẫu không đủ 50g thì lấy khoảng một nửa rồi thêm thể tích nước dùng để pha loãng cần thiết để có dung dịch pha loãng 10-1. Tổng thể tích trong bình trộn phải phủ hoàn toàn dao trộn.
Chuẩn bị tất cả các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo từ 90ml nước dùng để pha loãng và 10ml dung dịch mẫu thử pha loãng trước đó. Lắc các dung dịch pha loãng 25 lần với biên độ dao động 30cm.
3.5.2. Phương pháp kiểm tra cảm quan
Kiểm tra cảm quan theo TCVN 4834:1989 Thịt. Phương pháp và nguyên tắc đánh giá vệ sinh thú y.
Trạng thái đông lạnh:
- Tình trạng đóng gói
- Trạng thái bên ngoài: khối thịt đông cứng, lạnh dính tay, tình trạng cấp đông, khối thịt sạch không có tạp chất lạ, không có băng đá, không được rã đông;
- Màu sắc: đặc trưng cho từng loại sản phẩm.
- Trạng thái bên ngoài: bề mặt sản phẩm về độ đàn hồi, không dính tạp chất hay lạ; mỡ mềm, dai, định hình;
- Màu sắc: đặc trưng cho từng loại sản phẩm;
- Mùi: tự nhiên, đặc trưng cho từng loại sản phẩm, không có mùi lạ.
Trạng thái sau khi luộc chín:
- Mùi: đặc trưng cho từng loại sản phẩm, không có mùi lạ; - Vị: ngọt, đặc trưng cho từng loại sản phẩm;
- Nước luộc thịt: trong, váng mỡ to.
3.5.3. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật
3.5.3.1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thịt đông lạnh nhập khẩu theo TCVN 9977:2013)
Nguyên tắc chung:
Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20cm2. Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lại. Đĩa được ủ ấm ở 35oC ± 1oC trong 48 ± 3h rồi đếm khuẩn lạc.
Dung dịch dùng để pha loãng mẫu (dung dịch nước đệm phosphat).
Hòa tan 34g kali dihydro phosphat (KH2PO4) vào 500ml nước đựng trong bình định mức 1lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175ml dung dịch natri hydroxit 1 M và thêm nước đến vạch. Pha loãng 1,25ml dung dịch này đến 1 lít bằng nước đã đun sôi và để nguội, rồi hấp áp lực 15 phút ở 121oC.
Dung dịch dùng để pha loãng mẫu không được chứa xitrat, bisulfit hoặc thiosulfat vì có thể gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
Cách tiến hành:
Đặt đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí PetrifilmTM lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm màng mỏng phía trên ra và nhỏ 1ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền. Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù trên diện tích 20cm2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt gờ của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới). Lấy dụng cụ dàn mẫu ra và để yên đĩa trong 1 phút cho gel đông đặc lại. Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang
với nắp hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa, ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35oC ± 1oC trong 48 h ± 3h. Sau khi ủ xong, có thể bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng - 15oC đến 7 ngày nếu cần.
Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc. Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận tiện cho việc đếm. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu đỏ trên các đĩa chứa từ 30 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc.
Tính kết quả:
Để tính số lượng vi sinh vật hiếu khí, nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm tổng vi sinh vật hiếu khí.
Nếu không có đĩa nào có số đếm lớn hơn 30 khuẩn lạc có màu đỏ thì ghi lại số đếm chính xác trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha loãng nhất).
Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 300 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm2). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.
Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là "quá nhiều để đếm".
3.5.3.2. Xác định Escherichia coli trong thịt đông lạnh nhập khẩu theo TCVN 9975:2013
Nguyên lý:
Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm2. Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lạnh. Đĩa được ủ ấm ở 35 °C ± 1 °C trong thời gian thích hợp rồi đếm khuẩn lạc.
Cách tiến hành:
Đặtđĩa đếm E.coli/Coliform PetrifilmTM lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm màng mỏng phía trên ra và nhỏ 1ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền. Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù trên diện tích 20cm2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt láng của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới). Lấy dụng cụ dàn mẫu ra và để yên đĩa trong 1 phút cho gel đông đặc lại. Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa, ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35°C ± 1°C trong 48h ± 4h. Sau khi ủ xong, có thể bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng -15°C đến 7 ngày, nếu cần.
Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc. Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận tiện cho việc đếm. Các khuẩn lạc E coli có màu xanh kèm theo các bọt khí. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu xanh kèm theo một hoặc nhiều bọt khí (trong vòng đường kính một khuẩn lạc) trên các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Không đếm các khuẩn lạc phát triển ngoài vòng tròn giới hạn của môi trường chọn lọc, không đếm các bọt khí giả có thể được tạo ra do thao tác chưa đúng trong quá trình cấy mẫu lên đĩa.
Tính kết quả:
Để tính số lượng E.coli, nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm E.coli.
Nếu không có đĩa nào có số đếm lớn hơn 15 khuẩn lạc với màu đặc trưng kèm bọt khí trở lên thì ghi lại số đếm chính xác trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha loãng nhất).
Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 150 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm2). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.
quả được báo cáo là “quá nhiều để đếm”.
3.5.3.3. Định tính vi khuẩn Salmonella trong thịt đông lạnh nhập khẩu theo TCVN 05:2016/TYV2
Nguyên lý:
Quá trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm cần qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau: (1) Tăng sinh sơ bộ mẫu đã được đồng nhất để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ hoặc Salmonella đã bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh chọn lọc ở môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách và nhận dạng Salmonellakhỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu → (4) Khẳng định đặc tính sinh hóa, huyết thanh học. Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để phân lập Salmonellanhư: thạch XLD, HE,... Mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên các đặc tính sinh hoá đặc trưng tương ứng.
Cách tiến hành:
- Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình đã cắt nhỏ vào túi PE vô trùng
chuyên dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher ở tốc độ 260 vòng/phút trong 1 phút thu huyễn dịch có nồng độ 10-1
.Ủ huyễn dịch mẫu đã đồng nhất ở độ pha loãng 10-1 trong tủ ấm 37°C/18±2h.
- Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành trên 2 môi trường RVS và MKTTn.
Chuyển 0,1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS, ủ ở 41,5°C/24h.
Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24h.
- Phân lập trên môi trường đặc chọn lọc và nhận dạng:
Sau khi ủ, sử dụng dịch tăng sinh chọn lọc trên ria cấy lên bề mặt thạch đĩa XLD và HE.
Lật úp các đĩa đặt trong tủ ấm 37°C/24h.
- Khẳng định:
Nếu trên môi trường XLD hình thành khuẩn lạc màu hồng, trung tâm khuẩn lạc màu đen thì nghi là Salmonella.
điển hình trên lên bề mặt đĩa thạch máu. Ủ ấm ở 37°C/24h để thu được khuẩn lạc thuần nhất. Các khuẩn lạc thuần này được dùng để để khẳng định các tính chất sinh vật hoá học trên hệ thống VITEK 2 compact và làm phản ứng huyết thanh học (HTH) với kháng huyết thanh O, H đa giá. Trước khi làm phản ứng HTH cần kiểm tra khả năng tự ngưng kết của vi khuẩn. Nếu phản ứng tự ngưng kết âm tính ta tiếp tục tiến hành phản ứng ngưng kết với KHT O, H.
3.5.3.4. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng máy định danh Vitek2 compact
Nguyên lý
Máy định danh và làm kháng sinh đồ tự động Vitek2 compact hoạt động dựa trên nguyên lý theo dõi liên tục sự phát triển của vi khuẩn trong thẻ định danh (card). Phương pháp đinh danh vi sinh vật dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hóa học của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ. Phương pháp đo màu thực hiện theo nguyên lý sự suy giảm cường độ sáng: Hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng khi ánh sáng đi qua giếng. Hệ thống sử dụng các bước sóng 660n, 568nm, 428nm.
Card định danh gồm 64 giếng để kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi sinh vật.
Quy trình định danh + Chuẩn bị dụng cụ
- Phiếu xét nghiệm;
- Các loại thẻ định danh vi khuẩn gram dương (GP), gram âm (GN) bảo quản ở 2 - 8°C, các thẻ để ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi làm xét nghiệm;
- Máy đo độ đục chuẩn, kit chuẩn;
- Ống nghiệm vô trùng kích cỡ 12mm x 75mm để pha huyễn dịch vi khuẩn;
- Dung dịch nước muối NaCl 0,45% vô trùng;
- Dispenser, que cấy, đèn cồn, găng tay sạch, bút viết.
+ Chuẩn bị mẫu
- Các khuẩn lạc gram âm, gram dương được cấy thuần trên đúng các loại môi trường, đúng điều kiện ủ, tuổi khuẩn lạc.
+ Thực hiện
- Lấy ống nghiệm vô trùng đặt lên khay cassette;
- Hút nước muối: Dùng dispenser hút 3ml nước muối 0,45% vào ống nghiệm;
- Pha huyễn dịch: Lấy khuẩn lạc thuần đưa vào ống nghiệm, trộn đều và đưa vào máy đo độ đục: đạt khoảng 0,5 - 0,63 McFarland (vi khuẩn gram dương, và vi khuẩn gram âm);
- Lấy thẻ định danh và đặt vào khay cassette, đưa vào máy định danh; - Máy sẽ tự động định danh và trả lời kết quả.
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu.
Đánh giá các chỉ tiêu cảm quan, lý hóa và mức độ ô nhiễm vi khuẩn trong thịt theo TCVN 4834:1989.
Kết quả được tính toán và xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Excel 2010. Các tham số thống kê được tính toán gồm: dung lượng mẫu (n), số trung bình (Mean), sai số tiêu chuẩn (SE).
Sai số tiêu chuẩn (SE): là một đại lượng thống kê mô tả dùng để đo mức độ phân tán của một tập dữ liệu.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH KIỂM DỊCH ĐỘNG VẬT TRÊN CẠN NHẬP KHẨU VÀO VIỆT NAM QUA CẢNG HẢI PHÒNG CẠN NHẬP KHẨU VÀO VIỆT NAM QUA CẢNG HẢI PHÒNG
Trong những năm gần đây, Việt Nam ngày càng mở rộng quan hệ hợp tác giao thương với các nước trên thế giới, đẩy mạnh kim ngạch xuất nhập khẩu. Hàng hóa xuất nhập khẩu vào nước ta chủ yếu qua đường biển ở hai cảng lớn nhất là cảng Sài Gòn và cảng Hải Phòng.
Việt Nam trong thời kỳ mở cửa hội nhập đã trở thành thị trường xuất khẩu hướng tới của nhiều quốc gia trên thế giới. Các quốc gia xuất khẩu sản phẩm động vật sang Việt Nam chủ yếu từ Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Ấn Độ, Australia, Brazil, Tây Ban Nha, Đức… Hiện nay, các nước trên thế giới đều quản lý an toàn thực phẩm theo hệ thống HACCP hoặc ISO 22000:2005. Đặc biệt với các cơ sở, nhà máy sản xuất thực phẩm xuất nhập khẩu bắt buộc phải được cơ quan có thẩm quyền công nhận áp dụng hệ thống quản lý HACCP để kiểm soát các mối nguy đối với thực phẩm và đảm bảo an toàn về thực phẩm. Việt Nam cũng đã xây dựng hệ thống tiêu chuẩn, quy chuẩn quy định về mức giới hạn vi sinh vật, các