Phần 2 Tổng quan tài liệu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật
3.5.3.1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thịt đông lạnh nhập khẩu theo TCVN 9977:2013)
Nguyên tắc chung:
Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20cm2. Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lại. Đĩa được ủ ấm ở 35oC ± 1oC trong 48 ± 3h rồi đếm khuẩn lạc.
Dung dịch dùng để pha loãng mẫu (dung dịch nước đệm phosphat).
Hòa tan 34g kali dihydro phosphat (KH2PO4) vào 500ml nước đựng trong bình định mức 1lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175ml dung dịch natri hydroxit 1 M và thêm nước đến vạch. Pha loãng 1,25ml dung dịch này đến 1 lít bằng nước đã đun sôi và để nguội, rồi hấp áp lực 15 phút ở 121oC.
Dung dịch dùng để pha loãng mẫu không được chứa xitrat, bisulfit hoặc thiosulfat vì có thể gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
Cách tiến hành:
Đặt đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí PetrifilmTM lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm màng mỏng phía trên ra và nhỏ 1ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền. Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù trên diện tích 20cm2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt gờ của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới). Lấy dụng cụ dàn mẫu ra và để yên đĩa trong 1 phút cho gel đông đặc lại. Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang
với nắp hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa, ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35oC ± 1oC trong 48 h ± 3h. Sau khi ủ xong, có thể bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng - 15oC đến 7 ngày nếu cần.
Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc. Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận tiện cho việc đếm. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu đỏ trên các đĩa chứa từ 30 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc.
Tính kết quả:
Để tính số lượng vi sinh vật hiếu khí, nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm tổng vi sinh vật hiếu khí.
Nếu không có đĩa nào có số đếm lớn hơn 30 khuẩn lạc có màu đỏ thì ghi lại số đếm chính xác trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha loãng nhất).
Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 300 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm2). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.
Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là "quá nhiều để đếm".
3.5.3.2. Xác định Escherichia coli trong thịt đông lạnh nhập khẩu theo TCVN 9975:2013
Nguyên lý:
Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm2. Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lạnh. Đĩa được ủ ấm ở 35 °C ± 1 °C trong thời gian thích hợp rồi đếm khuẩn lạc.
Cách tiến hành:
Đặtđĩa đếm E.coli/Coliform PetrifilmTM lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm màng mỏng phía trên ra và nhỏ 1ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền. Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù trên diện tích 20cm2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt láng của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới). Lấy dụng cụ dàn mẫu ra và để yên đĩa trong 1 phút cho gel đông đặc lại. Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa, ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35°C ± 1°C trong 48h ± 4h. Sau khi ủ xong, có thể bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng -15°C đến 7 ngày, nếu cần.
Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc. Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận tiện cho việc đếm. Các khuẩn lạc E coli có màu xanh kèm theo các bọt khí. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu xanh kèm theo một hoặc nhiều bọt khí (trong vòng đường kính một khuẩn lạc) trên các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Không đếm các khuẩn lạc phát triển ngoài vòng tròn giới hạn của môi trường chọn lọc, không đếm các bọt khí giả có thể được tạo ra do thao tác chưa đúng trong quá trình cấy mẫu lên đĩa.
Tính kết quả:
Để tính số lượng E.coli, nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm E.coli.
Nếu không có đĩa nào có số đếm lớn hơn 15 khuẩn lạc với màu đặc trưng kèm bọt khí trở lên thì ghi lại số đếm chính xác trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha loãng nhất).
Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 150 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm2). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.
quả được báo cáo là “quá nhiều để đếm”.
3.5.3.3. Định tính vi khuẩn Salmonella trong thịt đông lạnh nhập khẩu theo TCVN 05:2016/TYV2
Nguyên lý:
Quá trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm cần qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau: (1) Tăng sinh sơ bộ mẫu đã được đồng nhất để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ hoặc Salmonella đã bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh chọn lọc ở môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách và nhận dạng Salmonellakhỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu → (4) Khẳng định đặc tính sinh hóa, huyết thanh học. Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để phân lập Salmonellanhư: thạch XLD, HE,... Mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên các đặc tính sinh hoá đặc trưng tương ứng.
Cách tiến hành:
- Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình đã cắt nhỏ vào túi PE vô trùng
chuyên dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher ở tốc độ 260 vòng/phút trong 1 phút thu huyễn dịch có nồng độ 10-1
.Ủ huyễn dịch mẫu đã đồng nhất ở độ pha loãng 10-1 trong tủ ấm 37°C/18±2h.
- Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành trên 2 môi trường RVS và MKTTn.
Chuyển 0,1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS, ủ ở 41,5°C/24h.
Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24h.
- Phân lập trên môi trường đặc chọn lọc và nhận dạng:
Sau khi ủ, sử dụng dịch tăng sinh chọn lọc trên ria cấy lên bề mặt thạch đĩa XLD và HE.
Lật úp các đĩa đặt trong tủ ấm 37°C/24h.
- Khẳng định:
Nếu trên môi trường XLD hình thành khuẩn lạc màu hồng, trung tâm khuẩn lạc màu đen thì nghi là Salmonella.
điển hình trên lên bề mặt đĩa thạch máu. Ủ ấm ở 37°C/24h để thu được khuẩn lạc thuần nhất. Các khuẩn lạc thuần này được dùng để để khẳng định các tính chất sinh vật hoá học trên hệ thống VITEK 2 compact và làm phản ứng huyết thanh học (HTH) với kháng huyết thanh O, H đa giá. Trước khi làm phản ứng HTH cần kiểm tra khả năng tự ngưng kết của vi khuẩn. Nếu phản ứng tự ngưng kết âm tính ta tiếp tục tiến hành phản ứng ngưng kết với KHT O, H.
3.5.3.4. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng máy định danh Vitek2 compact
Nguyên lý
Máy định danh và làm kháng sinh đồ tự động Vitek2 compact hoạt động dựa trên nguyên lý theo dõi liên tục sự phát triển của vi khuẩn trong thẻ định danh (card). Phương pháp đinh danh vi sinh vật dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hóa học của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ. Phương pháp đo màu thực hiện theo nguyên lý sự suy giảm cường độ sáng: Hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng khi ánh sáng đi qua giếng. Hệ thống sử dụng các bước sóng 660n, 568nm, 428nm.
Card định danh gồm 64 giếng để kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi sinh vật.
Quy trình định danh + Chuẩn bị dụng cụ
- Phiếu xét nghiệm;
- Các loại thẻ định danh vi khuẩn gram dương (GP), gram âm (GN) bảo quản ở 2 - 8°C, các thẻ để ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi làm xét nghiệm;
- Máy đo độ đục chuẩn, kit chuẩn;
- Ống nghiệm vô trùng kích cỡ 12mm x 75mm để pha huyễn dịch vi khuẩn;
- Dung dịch nước muối NaCl 0,45% vô trùng;
- Dispenser, que cấy, đèn cồn, găng tay sạch, bút viết.
+ Chuẩn bị mẫu
- Các khuẩn lạc gram âm, gram dương được cấy thuần trên đúng các loại môi trường, đúng điều kiện ủ, tuổi khuẩn lạc.
+ Thực hiện
- Lấy ống nghiệm vô trùng đặt lên khay cassette;
- Hút nước muối: Dùng dispenser hút 3ml nước muối 0,45% vào ống nghiệm;
- Pha huyễn dịch: Lấy khuẩn lạc thuần đưa vào ống nghiệm, trộn đều và đưa vào máy đo độ đục: đạt khoảng 0,5 - 0,63 McFarland (vi khuẩn gram dương, và vi khuẩn gram âm);
- Lấy thẻ định danh và đặt vào khay cassette, đưa vào máy định danh; - Máy sẽ tự động định danh và trả lời kết quả.