IV. Kết quả nghiên cứu.
d. Đánh giá kết quả và nhận xét:
- Hình 4.13 : Sắc ký đồ thể hiện phép thử định tính terpenoid. Hình 4.13.A thể hiện định tính các thành phần terpenoid (dạng genin)đ−ợc chấm mẫu với dịch chiết phân đoạn chloform. Hình 4.13.B thể hiện định tính các thành phần glycosid, với thuốc thử vanilin- acid sulfuric (TT2), trong đó có 1 vết màu xanh tím ở khoảng Rf 0,60 thể hiện đặc tr−ng cho d−ợc liệu nghiên cứu. Các mẫu mua trên thị tr−ờng thể hiện khác ( sắc ký đồ có vết màu vàng đậm ở khoảng Rf 0,55 ) và hầu hết có nguồn gốc từ Trung Quốc, do vậy có thể áp dụng để so sánh phân biệt với d−ợc liệu Đảng sâm của Trung Quốc.
- Hình 4.14 : Sắc ký đồ thể hiện phép thử định tính đ−ờng. ở Hình 4.14.A gồm có 2 vết chính ở vùng Rf 0,1 – 0,25 thể hiện đặc tr−ng cho d−ợc liệu. Các thành phần đ−ờng này chiếm tỷ lệ cao trong d−ợc liệu ( với l−ợng chấm có độ pha loãng gấp 5 lần so với l−ơng chấm của sắc ký đồ Hình 4.13), đặc biệt nhiều đối với các mẫu đảng sâm mua trên thị tr−ờng. Thành phần đ−ờng cho d−ơng tính với thuốc thử tetrrazolium blue (TT4 ) - định tính đ−ờng khử, là một trong số các đặc điểm đặc tr−ng của d−ợc liệu Đảng sâm.
Hình 4.13: Đảng sâm. Sắc ký đồ SKLM.
4.3.1.7. Xác định các đặc điểm hoá học đặc tr−ng của Đỗ trọng.
a. Mẫu khảo sát.
Tiến hành khảo sát trên 3 mẫu d−ợc liệu thu hái, 5 mẫu mua trên thị tr−ờng Việt Nam và 1 mẫu mua trên thị tr−ờng Trung Quốc. Địa chỉ mẫu đã đ−ợc ghi ở phụ lục 2.
b. Khảo sát các điều kiện phân tích.
Căn cứ vào kết quả phân tích sàng lọc nhóm chất, tiến hành khảo sát xác định các đặc điểm hoá học đặc tr−ng của d−ợc liệu Đỗ trọng theo h−ớng định tính các nhóm chất terpenoid glycosid. Thêm vào đó tiến hành khảo sát theo h−ớng định tính một số thành phần hoạt chất đã đ−ợc nói đến trong d−ợc liệu Đỗ trọng, cụ thể định tính phát hiện aucubin ( iridoid ) thuộc nhóm terpenoid glycosid và định tính nhóm chất lignan trên cơ sở định h−ớng xác định pinoresinol glycosid. Tiến hành khảo sát gồm các b−ớc nh− sau :
Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký:
- Dịch chiết methanol :3g d−ợc liệu tán nhỏ đ−ợc tiến hành loại chất nhựa keo bằng cách đun hồi l−u trên cách thuỷ ở nhiệt độ tối đa 600 C với 30ml chloroform, 3lần, thời gian mỗi lần 1 giờ. Loại bỏ phần dịch chloroform rồi tiếp tục chiết với methanol giống nh− đã ghi ở mục 3.3.2.1.b. Dịch chiết
methanol. Hoà cắn thu đ−ợc trong 2ml methanol, dùng làm dung dịch sắc ký, l−ợng chấm 10 àl.
Hệ dung môi sắc ký và phát hiện:
Tiến hành khảo sát theo h−ớng tách và phát hiện các thành phần terpenoid glycosid , iridoid và lignan ( glycosid ). Cách tiến hành nh− đã ghi ở mục 3.3.2.1c 3.3.2.1.d. Kết quả đã lựa chọn đ−ợc các hệ dung môi và thuốc thử phát hiện áp dụng cho định tính d−ợc liệu Đỗ trọng nh− đã ghi ở phần c.
c. Kết quả.
Kết quả xác định các đặc điểm hoá học đặc tr−ng của d−ợc liệu Đỗ trọng đ−ợc thể hiện trên các hình ảnh sắc ký đồ ở
Hình 4.15 và Hình 4.16 ( tr. 62). Điều kiện phân tích nh− sau :
Mẫu chấm sắc ký :
Mẫu nghiên cứu: C2.1, C 2.2, C 2.4. Chất đối chiếu : aucubin ký hiệu : A
Mẫu mua trên thị tr−ờng: S 3.2, S 3.4, S 3.5, S1.1 (TQ).
Hệ dung môi :
- Hình 4.15. Hệ 1: Chloroform : methanol : n−ớc : acid acetic(70: 30: 4: 1) - Hình 4.16.Hệ 2:Ethylacetat : acid acetic : acid formic : n−ớc (10: 1: 1 : 2,5)
Phát hiện :
- Hình 4.15. A . TT1 : P.dimethylaminobensaldehyd–acid hydrocloric B . TT2 : Vanilin – acid phosphoric
- Hình 4.16. A: UV 254nm B : TT2
d. Đánh giá kết quả và nhận xét.
- Hình 4.15 : Sắc ký đồ thể hiện phép thử định tính thành phần iridoid. Với TT1 các iridoid thừơng có màu xanh . Sắc ký đồ (Hình 4.15A) đã thể hiện có vết có cùng màu sắc và giá trị Rf so với aucubin đối chiếu. Kết quả đã thể hiện thành phần aucubin xuất hiện rõ ở các mẫu nghiên cứu trong đó mẫu C2.4 có mật độ vết lớn nhất, không xuất hiện hoặc rất nhạt ở các mẫu mua trên thị tr−ờng. Thành phần thuộc nhóm iridoid này cũng cho màu với thuốc thử phát hiện các thành phần terpenoid nói chung nh− vanillin- acid phosphoric (Hình 4.15B).
- Hình 4.16: Sắc ký đồ thể hiện phép thử định tính định h−ớng phát hiện thành phần lignan glycosid của d−ợc liệu, cụ thể : có hấp thụ tử ngoại và cho các màu đỏ đến tím với dung dịch acid sulphuric 20% hoặc với các thuốc thử phát hiện terpenoid. Đặc điểm của thành phần lignan này đ−ợc thể hiện rõ ở 2 vết ở vùng Rf 0,45-0,55 cho màu tối / UV254 ( Hình 4.16A) và màu tím với vanilin – acid phosphoric trên sắc ký đồ ( Hình 4.16B ).
- Kết quả xác định đặc điểm nh− đã nêu trên thể hiện đặc tr−ng cho các mẫu d−ợc liệu nghiên cứu. Các mẫu d−ợc liệu mua trên thị tr−ờng đã thể hiện các thành phần này ít hơn, đặc biệt là thành phần lignan thể hiện không rõ rệt.
Kết quả của phép thử định tính lignan trong các d−ợc liệu khảo sát sẽ là cơ sở để khai thác và xây dựng phép thử định tính “vân tay” nhóm chất này bằng kỹ thuật SKLCA.
4.3.1.8. Xác định các đặc điểm hoá học đặc tr−ng của Hà thủ ô.