IV. Kết quả nghiên cứu.
4.3.2.1.Xác định đặc điểm hoá học đặc tr−ng của Đỗ trọng.
a. Đối t−ợng mẫu khảo sát.
4.3.2.1.Xác định đặc điểm hoá học đặc tr−ng của Đỗ trọng.
a. Mẫu khảo sát.
Gồm các mẫu Đỗ trọng đã đ−ợc áp dụng khảo sát xác định đặc điểm hoá học đặc tr−ng bằng ph−ơng pháp SKLM nh− sau :
Mẫu nghiên cứu: D−ợc liệu thu hái, ký hiệu C2.1, C2.2, C2.4
Mẫu mua trên thị tr−ờng, ký hiệu S3.1, S3.2, S3.4, S3.5, S1.1( mua TQ).
b. Khảo sát các điều kiện phân tích.
Tiến hành khảo sát và lựa chọn các thông số của phép thử theo h−ớng định tính thành phần lignan glycosid của Đỗ trọng, gồm có các yếu tố liên quan nh− sau :
Xử lý mẫu :
3g d−ợc liệu tán nhỏ đ−ợc tiến hành chiết soxhlet với chloroform thời gian 6 giờ, loại bỏ dịch chiết chloroform, tiếp tục chiết nh− trên với methanol trong 6 giờ, lọc dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến gần cạn. Hoà cắn trong 2ml methanol đ−ợc dung dịch áp dụng cho sắc ký, l−ợng tiêm 20àl.
Pha tĩnh : Cột LiChrospher RP 18, 5àm, 250-4. Nhiệt độ cột : nhiệt độ phòng
Phát hiện: Detector tử ngoại ở các b−ớc sóng 277 nm.
Pha động:
Tiến hành khảo sát tách các thành phần phân tích với các pha động khác nhau, gồm có các hệ dung môi nh− sau :
- Hệ 1: Methanol : n−ớc ( 25 : 75 )
- Hệ 2 : Hỗn hợp 2 pha động(A và B) chạy theo ch−ơng trình gradient gồm có :
Thời gian ( phút)
Tốcđộ dòng ( ml/ phút)
%A %B Kiểu rửa giải 0 → 20 0,6 100 → 0 0 → 100 linear gradient.
20 → 40 0,6 0 100 Isocratic.
Trong đó A : Methanol : 20mM amoni dihydro phosphat pH 2,75 ( 5 : 95). B : Methanol : 20mM amoni dihydro phosphat pH 2,75 ( 80 : 20). - Hệ 3 : Pha động giống Hệ 2 với ch−ơng trình pha động nh− sau : Thời gian
( phút)
Tốcđộ dòng ( ml/ phút)
%A %B Kiểu rửa giải 0 → 40 0,6 100 → 0 0 → 100 linear gradient
40 → 53 0,6 0 100 Isocratic
53 → 55 0,6 0→ 100 100 → 0 linear gradient - Hệ 4 : Giống Hệ 3 với tốc độ dòng 0,7 ml/ phút.
Kết quả: Với pha động nh− Hệ 4 cho kết quả tách đạt yêu cầu hơn cả và đ−ợc chọn áp dụng cho phân tích.
c. Kết quả.
Tiến hành xác định đặc điểm đặc tr−ng của d−ợc liệu Đỗ trọng theo ph−ơng pháp SKLCA nh− đã nêu ở trên. Hình ảnh sắc ký đồ của các mẫu d−ợc liệu khảo sát đã đ−ợc ghi nhận (xem phụ lục 5 ). Các kết quả biểu thị các đặc điểm về thời gian l−u ( TR) và chiều cao (Au) của các pic chính (6 pic) đối với các mẫu đã khảo sát, đ−ợc tóm tắt ở bảng 4.3.
d. Nhận xét.
- Kết quả khảo sát trên 3 mẫu d−ợc liệu Đỗ trọng nghiên cứu ( mẫu thu hái ) nh− đã nêu ở bảng cho thấy, sắc ký đồ gồm có 6 pic có các đặc điểm nh− sau :
* Thời gian l−u TR : pic 1: 19,58 – 19,70; pic2: 21,36 – 21,63; pic3 : 22,23 - 22,55; pic 4 : 23,09 – 23,43; pic 5 : 23,91 – 24,24; pic 6 : 25,27- 25,50 phút.
* Chiều cao pic : Kết quả đo chiều cao pic của các mẫu, khi tiến hành trong cùng điều kiện giống nhau, là cơ sở để so sánh và đánh giá chất l−ợng của d−ợc liệu. Kết quả đo tổng 6 pic chính cho thấy, mẫu C2.4 có tổng lớn nhất trong số 3 mẫu d−ợc liệu nghiên cứu (C2.4 :10474.791; C2.2: 2484.908 và C2.1: 1841.795 Au), thể hiện chất l−ợng tốt hơn so với 2 mẫu còn lại (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiến hành khảo sát các mẫu d−ợc liệu Đỗ trọng mua trên thị tr−ờng trong cùng điều kiện để so sánh. Kết quả sắc ký đồ cho thấy, các mẫu này đều có các pic có thời gian l−u (TR) t−ơng tự nh− các mẫu thu hái, tuy nhiên có một số đặc điểm khác nh− :
* Số l−ợng Pic : Các mẫu mua trên thị tr−ờng xuất hiện thêm các pic ( 1-3 pic) có thời gian l−u lớn hơn của Pic 6 ( 26 – 32 phút ) thể hiện rõ trên sắc ký đồ của các mẫu S 3.4, S 3.5.
* Độ hấp thụ tính theo chiều cao pic : Kết quả đo tổng pic của các mẫu d−ợc liệu mua trên thị tr−ờng khảo sát đều thấp hơn nhiều so với mẫu thu hái (
S3.1: 184.006; S1.1: 290.249; S3.4: 1107.650 và S3.5: 98.105Au. ), mẫu S3.5 có kết quả đo tổng pic rất thấp thể hiện chất l−ợng d−ợc liệu rất kém.
Bảng 4.3. Kết quả sắc ký đồ xác định “vân tay” thành phần “lignan” của d−ợc liệu đỗ trọng bằng ph−ơng pháp SKLCA.
Ghi chú : TR : Thời gian l−u của pic, đơn vị tính : phút
Au : Độ hấp thụ tính theo chiều cao pic