III. Đối t−ợng và ph−ơng pháp nghiên cứu 3.1 Đối t−ợng nghiên cứu.
b.Xử lý mẫu (chuẩn bị mẫu chấm sắc ký):
Một trong những −u điểm của kỹ thuật SKLM là loại sắc ký mở có pha tĩnh là các bản mỏng chỉ dùng một lần do vậy việc xử lý mẫu không đòi hỏi khắt khe nh− các loại sắc ký cột khác. Dịch chiết d−ợc liệu áp dụng cho phân tích bằng ph−ơng pháp SKLM thông th−ờng nhất vẫn là dịch chiết methanol. Tuy nhiên trong một số tr−ờng hợp cần thiết ta có thể áp dụng dịch chiết với các dung môi khác có độ phân cực khác nhau, với mục đích làm giàu thành phần nhóm chất cần phân tích và loại bớt tạp chất gây cản trở cho việc tách và phát hiện nhóm chất đó.
Căn cứ vào các nhóm chất đã đ−ợc định h−ớng xác định “vân tay” của mỗi d−ợc liệu, thu đ−ợc từ kết quả phân tích sàng lọc nhóm chất nh− đã nêu ở trên , tiến hành lựa chọn cách xử lý mẫu phù hợp với nhóm chất cần xác định của d−ợc liệu đó , trong số các dịch chiết d−ợc liệu nh− đã nêu d−ới đây − Dịch chiết methanol:
1 gam là đến 2 gam thân, rễ, hoặc thân rễ d−ợc liệu đã đ−ợc tán nhỏ,đ−ợc chiết với methanol tỷ lệ 1g/10ml bằng cách đun hồi l−u trên cách thuỷ khoảng 30 phút, gạn lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn. Hoà cắn thu đ−ợc trong 2 ml methanol, đ−ợc dùng làm dung dịch chấm sắc ký.
− Dịch chiết với các dung môi khác : n.hexan, etherethylic, chloroform hoặc ethylacetat.
Cách tiến hành : D−ợc liệu sau khi đã đ−ợc chiết với methanol nh− đã nêu ở mục dịch chiết methanol, phần cắn sau khi làm bay hơi hết methanol đ−ợc hoà vào 5ml n−ớc và tiến hành lắc với một trong số các dung môi nh− đã nêu ở trên, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn. Hoà cắn thu đ−ợc trong 1 đến 2ml methanol, thu đ−ợc dung dịch chấm sắc ký.
* Dịch chiết n hxan, ether ethylic và dịch chiết chloroform th−ờng đ−ợc áp dụng trong phân tích các thành phần kém phân cực nh− tinh dầu, terpenoid dạng genin, coumarin và anthranoid dạng aglycon ví dụ : Dịch chiết etherethylic đ−ợc áp dụng xác định thành phần anthranoid của d−ợc liệu Ba kích, dịch chiết n.hexan xác định thành phần kém phân cực của Cỏ nhọ nồi…
* Dịch chiết ethylacetat th−ờng đ−ợc áp dụng trong phân tích các thành phần thuộc nhóm flavonoid, anthranoid, các acid phenolcarboxylic ... với mục đích làm giầu thêm các thành phần phân tích nói trên và loại bớt các thành phần tạp phân cực hơn tan đ−ơc trong methanol gây trở ngại cho triển khai sắc ký. Một số d−ợc liệu có trong đề tài đã đ−ợc tiến hành xử lý mẫu d−ới dạng dịch chiết ethylacetat nh− : Bồ công anh, Cẩu tích...
− Dịch chiết phân đoạn :
Dịch chiết phân đoạn đ−ợc tiến hành dựa trên nguyên tắc chiết phân bố lần l−ợt với các dung có độ phân cực khác nhau từ kém phân cực đến phân cực Cách tiến hành : D−ợc liệu sau khi chiết với methanol nh− đã nêu ở mục dịch chiết methanol, phần cắn sau khi làm bay hơi hết methanol đ−ợc hoà vào 5ml n−ớc và tiến hành chiết bằng cách lắc lần l−ợt với các dung môi từ kém phân cực(n.hexan, etherethylic, chloroform)đến phân cực( ethylacetat, n.butanol). Gạn lấy phần các dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn. Hoà cắn thu đ−ợc trong methanol làm dung dịch chấm sắc ký.
Dịch chiết phân đoạn đ−ợc áp dụng trong một số tr−ờng hợp với mục đích loại tạp ví dụ nh− dịch chiết phân đoạn chloroform trong định tính đỗ trọng dùng để loại chất nhựa gây cản trở cho quá trình sắc ký; làm giàu thành phần nhóm chất cần phân tích và định h−ớng phát hiện thành phần đặc tr−ng của d−ợc liệu theo tài liệu đã công bố, ví dụ : Dịch chiết phân doạn ethylacetat của Hà thủ ô, mục đích định tính thành phần stilben glycoside, là thành phần
hoạt chất đ−ợc nói đến có trong Hà thủ ô; dịch chiết phân đoạn ethylacetat của Đảng sâm với định h−ớng định tính lignan.
− Dịch chiết chloroform trong môi tr−ờng kiềm:
Cách tiến hành : 3 gam ( lá) đến 5gam ( rễ, thân rễ) d−ợc liệu đ−ợc làm ẩm bằng 2- 3ml dung dịch amoniac 25%, đ−ợc lắc với 50ml chloroform, thời gian 2-3 giờ . Gạn lọc lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn. Hoà cắn thu đ−ợc trong 1ml methanol đ−ợc dùng làm dung dịch chấm sắc ký, l−ợng chấm 20 - 30àl.
Dịch chiết chloroform trong môi tr−ờng kiềm đ−ợc áp dụng phân tích đa số các thành phần alcaloid. D−ợc liệu đ−ợc tiến hành chiết theo cách này, áp dụng định tính alcaloid của Dây đau x−ơng.
− Dịch chiết methanol- n−ớc :
Đ−ợc áp dụng trong phân tích các thành phần đ−ờng . acid amin và các thành phần phân cực khác.
Cách tiến hành : 2 gam ( lá) hoặc 3 gam ( rễ, thân rễ) d−ợc liệu đ−ợc đun hồi l−u trên cách thuỷ với 25ml hỗn hợp methanol và n−ớc tỷ lệ 4: 1 . Gạn , lọc lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn . Hoà cắn thu đ−ợc trong 2ml hỗn hợp dung môi trên và đ−ợc dùng để chấm sắc ký . L−ợng chấm 10- 15 àl
− Dịch chiết thu đ−ợc bằng ph−ơng pháp cất kéo hơi n−ớc :
Cách tiến hành theo ph−ơng pháp định l−ợng tinh dầu trong d−ợc liệu nh− đã ghi trong D ĐVN III ( phần phụ lục 9.2). Định l−ợng tinh dầu trong d−ợc liệu. − Dịch chiết thu đ−ợc từ sản phẩm thuỷ phân :
Trong một số tr−ờng hợp tiến hành xác định đặc điểm hoá học đặc tr−ng của một nhóm chất d−ới dạng sản phẩm thuỷ phân thành genin của nó, tỏ ra có hiệu quả trong định tính phát hiện d−ợc liệu. Ph−ơng pháp thuỷ phân các glycosid th−ờng đ−ợc tiến hành bằng cách đun sôi dung dịch chế phẩm trong môi tr−ờng chứa acid hydrocloric hoặc acid sulfuric 10%, thời gian từ 30 phút cho đến 1 giờ, tuỳ thuộc vào bản chất của từng loại glycosid .
Ph−ơng pháp đă đ−ợc áp dụng thuỷ phân anthranoid trong d−ợc liệu Thảo quyết minh với cách tiến hành nh− sau :
2g d−ợc liệu đã đ−ợc tán nhỏ, đ−ợc chiết với methanol theo ph−ơng pháp nh− đã ghi ở mục 3.3.1.a. Hoà cắn thu đ−ợc trong 10ml n−ớc và 1ml acid hydrocloric, đun trên cách thuỷ 30 phút, làm lạnh, chiết bằng cách lắc với 20ml ether ethylic, gạn lấy phần dịch ether ethylic và làm bay hơi hết dung môi . Hoà cắn thu đ−ợc trong 1ml chloroform, đ−ợc dung dịch chấm sắc ký định tính thành phần anthranoid dạng aglycon.