- Bảo quản: quá trình bảo quản hạt giống cũng là giai đoạn mà nấm bệnh có
3.3.4.1.Phương pháp giải trình tự gen
a, Lựa chọn vùng gen nghiên cứu
là một trong các vùng gen phổ biến nhất để nghiên cứu đa dạng sinh học và xác định nhiều loài nấm. Các rDNA của nấm được tổ chức thành các đơn vị phiên mã, mỗi đơn vị phiên mã có thể được lặp lại nhiều lần trên bộ genome. Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các đơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần và kề nhau thành các cụm đơn vị phiên mã. Một đơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S- 5.8S-28S. Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS ký hiệu là ITS1 (ở đầu 5’) và ITS2 (ở đầu 3’) (hình 3.1).
Hình 3.1. Sơ đồ minh họa các cụm gen rDNA của sinh vật nhân thật
Nguồn Bridge et al. (2007). Vùng ITS1 và ITS2 được chỉ bằng mũi tên.
Các vùng ITS, do có tốc độ đột biến nhìn chung tương ứng với tốc độ biệt hóa loài (tiến hóa trung tính) nên có thể phân biệt mối quan hệ tới mức loài như đã được chứng minh đối với nấm Phytophthora (Duncan and Cooke, 2002).
b, PCR và giải trình tự nấm B. oryzae
DNA được chiết từ các mẫu nấm B. oryzae nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle and Doyle (1987). DNA được hòa trong 50 µL đệm TE và bảo quản ở -200C.
Hai mồi ITS1 và ITS2 (White et al., 1990) đã được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm. Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 500C.
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose, dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng
Vùng liên gen
Vùng đệm giữa các gen Vùng đệm giữa
các gen
tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR và kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR (Hãng Macrogen). Trình tự nucleotide của nấm được biên tập và lắp ráp bằng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
c, Phân tích trình tự nấm B. oryzae
Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information).
Phân tích trình tự được thực hiện bằng phầm mềm ClustalX và MEGA5.1.