- Bảo quản: quá trình bảo quản hạt giống cũng là giai đoạn mà nấm bệnh có
23 P6ĐB-III695 P6 đột biến Thanh hóa
Hiện nay có nhiều phương pháp nghiên cứu tìm hiểu sự đa dạng sinh học nhưng trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành trên vùng ITS của nấm B. oryzae,
hai mồi ITS1 và ITS2 (White et al., 1990) đã được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm. Vùng liên gien ITS (internally transcribed spacers) của cụm gien rDNA là một trong các vùng gen phổ biến nhất để nghiên cứu đa dạng và xác định nhiều loài nấm. Các rDNA của nấm được tổ chức thành các đơn vị phiên mã. Mỗi đơn vị phiên mã có thể được lặp lại nhiều lần trên bộ genome. Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các đơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần và kề nhau thành các cụm đơn vị phiên mã. Một đơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S- 5.8S-28S. Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS ký hiệu là ITS1 (ở đầu 5’) và ITS2 (ở đầu 3’).
DNA được chiết từ các mẫu nấm B. oryzae nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle and Doyle (1987). DNA được hòa trong 50 µL đệm TE và bảo quản ở -200C. Vùng ITS của 10 mẫu nấm đã được nhân bằng PCR dùng cặp mồi ITS1 và ITS2, có 8 mẫu cho kết quả tốt, một mẫu trung bình và một mẫu bị nhiễu. Sản phẩm PCR thu được với kích thước 640 bp (hình 4.8).
640 bp
Hình 4.8. Sản phẩm PCR của nấm B. oryzae
Sau khi lắp ráp và loại bỏ các đoạn nhiễu ở 2 đầu, các mẫu đều có kích thước đoạn đọc được 539 nucleotide (bảng 4.19). Loại bỏ các mẫu bị nhiễu và chất lượng kém, đoạn đọc được của cả 8 mẫu đều chứa vùng ITS1 và ITS2 cần cho phân tích. Nguồn gốc các mẫu nấm B. oryzae giải trình tự thành công được trình bày tại bảng 4.20, trình tự gen được trình bày trong phần phụ lục.
Bảng 4.19. Kết quả giải trình tự vùng ITS của 10 mẫu nấm B. oryzae
thu thập tại các tỉnh phía Bắc và ven biển miền Trung
STT Mẫu nấm Mã giải trình tự Chất lượng trình tự Đoạn đọc được (bp)
1 Số 4 163DZAB010 Tốt 539 2 Số 10 163DZAB012 Tốt 539 3 Số 15 163DZAB013 Trung bình 201 4 Số 17 163DZAB014 Tốt 539 5 Số 21 163DZAB015 Tốt 539 6 Số 24 163DZAB016 Tốt 539 7 Số 70 163DZAB017 Nhiễu 8 Số 248 163DZAB018 Tốt 539 9 Số 557 163DZAB019 Tốt 539 10 Số 695 163DZAB020 Tốt 539
Bảng 4.20. Nguồn gốc các mẫu nấm B. oryzae phân lập từ hạt giống lúa
STT Mẫu nấm Thu thập từ giống lúa Ký hiệu kiểu hình Địa điểm thu thập
1 Số 4 Băc thơm số 7 V4 Ninh Bình
2 Số 10 Việt lai 50 IV10 Hà Nội (Gia Lâm)
3 Số 15 Nhị ưu 838 III15 Nam Định
4 Số 17 QN1 IV17 Bắc Giang
5 Số 21 QR 1 III21 Hải Phòng
6 Số 24 Hương thơm số 1 I24 Thái Bình
7 Số 70 X26 II70 Nghệ An
8 Số 248 Khang dân 18 I248 Điện Biên
9 Số 557 IR 353-66 V557 Hà Tĩnh
10 Số 695 P6 đột biến III695 Thanh hóa
4.2.2.2. Trình tự tương đồng trên Gen Bank
Tìm kiếm trình tự tương đồng được thực hiện bằng phần mềm tìm kiếm trực tuyến (Blast search), dùng các trình tự đọc được làm chuỗi hỏi (query). Tám mẫu nấm số 4, số 10, số 17, số 21, số 24, số 248, số 557, số 695 là loài Cochliobolus miyabeanus (C. miyabeanus) hay còn gọi là B. oryzae (bảng 4.21).
Bảng 4.21. Kết quả tìm kiếm các trình tự gần gũi trên GenBank
STT Mẫu
nấm Mã số
Loài gần gũi nhất trên Genbank (%) đoạn so sánh (%) đồng nhất trình tự Tên loài Nguồn
gốc Mã Genbank 1 Số 4 163DZAB010 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 2 Số 10 163DZAB012 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 3 Số 17 163DZAB014 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 4 Số 21 163DZAB015 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 5 Số 24 163DZAB016 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 6 Số 248 163DZAB018 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 7 Số 557 163DZAB019 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 8 Số 695 163DZAB020 C.miyabeanus Nhật Bản JN943398 100 100 Mức đồng nhất trình tự của 8 mẫu nấm là 100%, mức đồng nhất trình tự 100% trên toàn bộ đoạn so sánh với mẫu nấm C. miyabeanus nguồn gốc từ Nhật Bản có mã Genbank là JN943398 (bảng 4.21). Hình thái khác nhau của nấm
B. oryzae thu thập trên hạt và trên môi trường nuôi cấy cũng đều cho kết quả giống nhau tại vùng gen ITS1 và ITS2. Tương tự như vậy trình tự tại vùng gen ITS1 và ITS2 của các mẫu nấm B. oryzae thu thập tại miền bắc và miền Trung cũng không nhau. Như vậy để tìm thấy sự đa dạng sinh học các mẫu nấm B. oryzae tại Việt Nam cần có các nghiên cứu sâu hơn về đa dạng sinh học của nấm B. oryzae bằng các phương pháp khác.
4.2.2.3. Mức đồng nhất trình tự của mẫu nấm Việt Nam với thế giới
Ngoài mẫu nấm C. miyabeanus từ Nhật Bản (mã Genbank là JN943398) có độ đồng nhất trình tự 100% trên toàn bộ đoạn so sánh còn có 23 trình tự gần gũi với 8 mẫu nấm nghiên cứu (bảng 4.22). 23 trình tự tìm thấy là loài C. miyabeanus trên các cây ký chủ thuộc họ hòa thảo như lúa, lúa dại, niễng, cỏ ngọt, cỏ lồng vực, ngô, cá biệt có trình tự công bố năm 2012 thu được tại Iran gây hại trên chuối.
Lựa chọn 20 mẫu B. oryzae và 10 mẫu loài Bipolaris khác trên Genbank để so sánh mức đồng nhất với các mẫu B. oryzae thu thập tại Việt Nam. Trình tự gen của 8 mẫu nấm thu thập trên 8 giống lúa tại 8 tỉnh khác nhau đã cho kết quả giống nhau tại vùng gen ITS1 và ITS2. Tại vùng gen ITS1 và ITS2 các mẫu B. oryzae thu thập tại Việt Nam đồng nhất với nhóm B. oryzae đã được công bố trên thế giới từ
82,2% trở lên, đồng nhất với nhóm loài Bipolaris khác đã được công bố trên thế giới từ 81,1% trở lên (bảng 4.23).
Phân tích phả hệ dùng các trình tự mẫu nấm B. oryzae của Việt Nam và trình tự của các loài được xác định thông qua tìm kiếm Blast cũng cho kết quả tương tự. Các mẫu trình tự thu được phân nhóm chặt chẽ với cụm loài tương ứng của chúng.
Bảng 4.22. Nguồn gốc các trình tự trên thế giới gần gũi nhất với trình tự của các mẫu nấm nghiên cứu
STT Mã
Genbank Loài nấm Nguồn gốc Cây ký chủ
Năm công bố 1 JF693910 C. miyabeanus Mỹ Panicum virgatum (cỏ bụi) 2011 2 KF688970 C. miyabeanus Trung quốc Zizania latifolia (cây niễng) 2013
3 GU373634 C. miyabeanus Ấn độ Lúa 2009