3.3.1. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Q22
Bảng 3.6. Các đặc tính probiotic của chủng Q22
Đặc tính probiotic Đánh giá chung
1. Khả năng đối kháng với VK kiểm định
E. coli K88 Mạnh (2,10 cm)
Sal. typhimurium Mạnh (2,10 cm)
Shigella sp. Mạnh (2,40 cm)
2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Protease Rất mạnh (2,50 cm)
Amylase Trung bình (1,70 cm)
Cellulase Rất mạnh 2,60 cm)
3. Khả năng chịu muối mật ở các nồng độ khác nhau, sau 4 giờ khảo sát
0,5% Cao (116,83%)
1,0% Cao (108,95%)
2,0% Cao (105,85%)
4. Khả năng chịu pH dạ dày ở các mức pH khác nhau, sau 180 phút khảo sát
pH1,5 Đạt 14,14%
pH2,0 Đạt 45,93%
pH2,5 Đạt 76,23%
Như vậy, có thể thấy rằng chủng Q22 có các đặc tính phù hợp với yêu cầu tạo chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi heo.
3.3.2. Định danh chủng tuyển chọn bằng SHPT
Hình thái khuẩn lạc (×4) Hình thái tế bào (×100) Hình thái bào tử (×100)
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Q22
Chúng tôi gửi chủng Q22 đến công ty xét nghiệm Nam Khoa để định danh bằng cách giải trình tự gen 16S-rARN và so sánh với ngân hàng gen. Kết quả, trình tự gen 16S rRNA của chủng Q22 như sau:
TTTGGAGAGTTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGC CTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTT AGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGG GATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCA TGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCG CGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGC GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAACTTTCCGCAATGGACGA AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTA AAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACC TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG.
So sánh với trình tự 16S-rARN của loài VK đã được định danh trong ngân hàng gen NCBI. Kết quả cho thấy mức độ giống nhau của chủng Q22 với loài B. amyloliquefaciens là 99%. Kết này cho phép kết luận chủng Q22 là B. amyloliquefaciens và chúng tôi gọi chủng này là B. amyloliquefaciens Q22.
Được biết B. amyloliquefaciens rất phổ biến trong đất. Đây có thể là chủng VK rất an toàn cho người và động vật, được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme vì nó có khả năng sinh các loại enzyme như amylase, serine protease, metallo protease [43], lipase [55], phytase, xenlulase và xylanase [47]. Ngoài ra, B. amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các lĩnh vực khác như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [52], [53], chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA [43], [52], [53], [60]. Chúng còn được biết đến trong kĩ thuật di truyền nhờ khả năng sinh tổng hợp enzyme cắt hạn chế Bam HI [52], [56]. Ngoài ra, chủng B. amyloliquefaciens Q22 mà chúng tôi nghiên cứu được phân lập từ các mẫu phân heo ở giai đoạn trưởng thành và khỏe mạnh nên có độ an toàn cao. Từ đó cho thấy chủng nghiên cứu của chúng tôi tuyển chọn được dùng tạo chế phẩm probiotic là hoàn toàn có cơ sở.
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của
các chủng Bacillus đã tuyển chọn
Theo một số nhà khoa học (Priest et al., 1987; Todar, 2008), khả năng ST của hầu hết các loài thuộc chi Bacillus chịu tác động đồng thời của nhiều yếu tố cả về thành phần MT lẫn điều kiện nuôi cấy. Với điều kiện nuôi cấy và thành phần MT thích hợp, các chủng Bacilluskhông những ST tốt mà còn có thể sinh tổng hợp chất kháng khuẩn với hoạt tính cao.
Dựa vào một số công trình nghiên cứu trong lĩnh vực trên, chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ST cũng như tăng sinh khối TB của chủng Bacillus như: thời gian nuôi cấy, MT nuôi cấy, tỉ lệ cấy giống vào MT, nguồn C, nguồn N, pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy,…
3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Để xác định thời điểm nuôi cấy thích hợp cho sự ST và sinh chất kháng khuẩn của chủng B. amyloliquefaciens Q22, nhằm thu nhận sinh khối TB hiệu quả sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng nghiên cứu trên MT2 ở nhiệt độ phòng. Thu nhận mẫu tại các thời điểm 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ.
Kiểm tra mật độ TB và hoạt tính kháng khuẩn của chủng trên. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.7 và hình 3.4.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối và
hoạt tính kháng khuẩn của chủng B. amyloliquefaciens Q22
Thời gian (giờ) Mật độ tế bào (OD620nm)
Hoạt tính đối kháng với
E. coli (D-d, cm) 0 0,001 0,00 12 1,290 ± 0,016 1,30 ± 0,04 24 2,264 ± 0,007 2,08 ± 0,01 36 2,257 ± 0,006 2,05 ± 0,03 48 1,840 ± 0,004 1,12 ± 0,06 60 1,565 ± 0,011 0,85 ± 0,01 72 1,450 ± 0,001 0,60 ± 0,03
12 giờ 24 giờ 36 giờ
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng B. amyloliquefaciens đối với E.
coli được nuôi cấy qua các khoảng thời gian khác nhau
Nhận xét: Qua số liệu ở bảng 3.7 chúng tôi nhận thấy, sự ST của chủng B. amyloliquefaciensQ22 đạt cực đại ở thời điểm 24 giờ (OD620= 2,264), tương đối ổn định đến 36 giờ (OD620= 2,257) và sau đó giảm dần. Như vậy, có thể xác định đường cong ST của chủng B. amyloliquefaciens 22 như sau (Phụ lục 4): pha tiềm
phát từ 0-12 giờ, pha logarit từ 12-24 giờ, pha ổn định từ 24-36 giờ (TB ở trạng thái cân bằng động nên mật độ TB có khi tăng, giảm tuy nhiên luôn ổn định) và pha suy vong ở thời điểm sau 48 giờ. Hoạt tính đối kháng của chủng nghiên cứu đạt cực đại ở thời điểm 24 giờ, ổn định đến 36 giờ, sau đó giảm nhẹ và giảm mạnh sau 48 giờ nuôi cấy. Như vậy, chất kháng khuẩn có thể được tạo ra từ pha log trong quá trình ST. Khi mật độ TB của chủng nghiên cứu giảm, thì hoạt tính kháng khuẩn của nó cũng giảm theo. Điều này có thể giải thích là do trong giai đoạn này, chất dinh dưỡng trong MT nuôi cấy bắt đầu cạn kiệt, các sản phẩm trao đổi chất được sinh ra nhiều, không còn nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp chất kháng khuẩn. Và cũng có thể, trong giai đoạn này trong MT nuôi cấy xuất hiện các sản phẩm trao đổi chất bất lợi cho sự ST nên hiệu quả kháng khuẩn cũng giảm theo.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Trần Trường Nhân (2009) khi nghiên cứu các chủng B. subtylis phân lập từ phân heo cho hoạt tính đối kháng với E. coli
mạnh nhất sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trường TSB. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Đào Thị Thanh Xuân (2008) khi nghiên cứu khả năng sinh chất kháng khuẩn của một số chủng Bacillus đối kháng với vi khuẩn V. furnissii (gây bệnh cho tôm, cá).
Như vậy, để thu sinh khối chủng B. amyloliquefaciensQ22 hiệu quả có thể thu ở thời điểm 24 giờ. Đây là giai đoạn chuyển từ pha logarit sang pha phát triển ổn định trong quá trình ST. Tại thời điểm này, mật độ TB và hoạt tính kháng khuẩn thể hiện mạnh nhất. Vì vậy, thu sinh khối ở thời điểm này là tốt nhất.
3.4.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống
Sau khi hoạt hóa, chủng B. amyloliquefaciens Q22 được cấy nhân giống vào MT2 với điều kiện: nhiệt độ phòng, pH 7-7,5, lắc 180 vòng/phút trong 24 giờ. Sau đó giống được bổ sung vào MT nuôi cấy với tỉ lệ thích hợp.
Bảng 3.8. Số lượng TB theo tỉ lệ giống cấy vào MT Tỉ lệ giống VK (%) Thể tích canh khuẩn (ml) Thể tích môi trường (ml) Mật độ TB (OD620) Số lượng TB (CFU/ml) 1 0,5 50 0,469 ± 0,007 9,80.108 2 1,0 50 2,351 ± 0,002 4,91.109 3 1,5 50 2,353 ± 0,001 4,92.109 4 2,0 50 2,348 ± 0,002 4,91.109 5 2,5 50 2,350 ± 0,010 4,91.109 6 3,0 50 2,347 ± 0,002 4,90.109 7 3,5 50 2,350 ± 0,001 4,91.109 8 4,0 50 2,340 ± 0,002 4,89.109 9 4,5 50 2,329 ± 0,001 4,87.109 10 5,0 50 2,325 ± 0,011 4,86.109
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, khi tăng tỉ lệ giống cấy từ 1-10% thì số lượng TB cũng tăng theo và đạt cao nhất là 4,92.109
(CFU/ml)ở tỉ lệ cấy giống 3%. Tuy nhiên số lượng TB ở tỉ lệ cấy giống 2% (4,91.109 (CFU/ml))và 3% (4,92.109 (CFU/ml)) chênh lệch không đáng kể. Nên chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống cấy vào MT nuôi cấy là 2%.
3.4.3. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy
Quá trình tạo sinh khối TB phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện và thành phần MT nuôi cấy. Do đó, việc nghiên cứu lựa chọn MT thích hợp cho mục đích này là điều rất cần thiết. Song vấn đề đặt ra là phải tìm được MT thích hợp nhưng đơn giản, với nguyên liệu tương đối rẻ tiền phù hợp với điều kiện sản xuất chế phẩm sinh học ở nước ta.
Để khảo sát ảnh hưởng của MT lên khả năng ST của chủng nghiên cứu, chúng tôi nuôi chủng này trên các MT khác nhau (MT2, MT3, MT4 và MT5 như đã trình bày trong phần 2.2.). Sau 24 giờ nuôi cấy xác định mật độ TB (OD620). Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và hình 3.5.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của
chủng B. amyloliquefaciens Q22
STT Môi trường Mật độ tế bào (OD620nm)
1 MT2 2,145 ± 0,003
2 MT3 0,958 ± 0,012
3 MT4 2,390 ± 0,003
4 MT5 2,281 ± 0,002
Hình 3.5. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của
chủng B. amyloliquefaciens Q22
Nhận xét: Qua kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng, MT4 vẫn là MT thích hợp nhất cho sự ST của chủng nghiên cứu. Vì vậy mà mật độ TB của chủng này đạt cực đại (OD620= 2,390) sau 24 giờ nghiên cứu. Điều này có thể giải thích là do trong thành phần của MT4 có cao thịt, peptone cung cấp nguồn N và đường glucose đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng C của Bacillus. Đây là các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho quá trình ST và PT của các chủng Bacillus.
Ở MT5 cũng chứa các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho quá trình ST và PT của các chủng Bacillusnhư tryptone, soytone, glucose nên mật độ TB tương đối cao (OD620= 2,281) xấp xỉ mật độ TB ở MT4. Tuy nhiên, xét về hiệu quả kinh tế, các thành phần trong MT4 có giá thành rẻ hơn so với MT5 nên chúng tôi chọn MT4 để thu sinh khối TB của B. amyloliquefaciensQ22. Đây cũng là MT mà các tác giả
Đào Thị Thanh Xuân (2008), Văn Thị Thủy (2011) sử dụng để nghiên cứu các đặc tính probiotic và thu sinh khối của các chủng Bacillus.
Theo báo cáo của Trần Quốc Việt và cộng sự (2008), nhóm Bacillus có khả năng ST mạnh ở hầu hết các loại MT, kể cả các MT không đặc trưng cho chúng. Đó là các đặc tính rất quí của các chủng Bacillus khi chúng thật sự là những VK hữu ích được sử dụng như nguồn probiotic dùng trong chăn nuôi. Tuy nhiên, MT dùng để nuôi thu sinh khối VK cần đảm bảo đủ thành phần chất dinh dưỡng và một yêu cầu đối với sản xuất công nghiệp là nguyên liệu phải rẻ tiền [39].
3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn C
Mỗi SV trong quá trình ST và PT đều cần được cung cấp nguồn C để sinh tổng hợp vật liệu tế bào và tạo ra năng lượng cần cho hoạt động sống. Nguồn C chủ yếu mà VSV thường sử dụng là glucose, saccharose, lactose,…Ngoài ra, VSV còn có thể sử dụng rỉ đường, tinh bột và các hợp chất hữu cơ khác (Furch et al., 2007) [40]. Việc lựa chọn nguồn C thích hợp là rất quan trọng nhằm tìm ra nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm mà vẫn đảm bảo cho VSV phát triển để thu sinh khối TB cao nhất.
Tiến hành nuôi cấy chủng B. amyloliquefaciens Q22 trên MT4, thay đổi nguồn carbon bằng các loại đường glucose, maltose, lactose, rỉ đường, sucrose.
Sau 24 giờ thu nhận mẫu, xác định mật độ TB (OD620). Kết quả được thể hiện qua bảng 3.10 và hình 3.6.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn C đến sự tạo thành sinh khối của chủng
B. amyloliquefaciens Q22
STT Nguồn carbon Mật độ tế bào (OD620nm)
1 Glucose 2,410 ± 0,002
2 Lactose 2,475 ± 0,012
3 Sucrose 2,274 ± 0,011
4 Maltose 2,330 ± 0,003
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn C đến sự tạo thành sinh khối của chủng
B. amyloliquefaciens Q22
Nhận xét: Qua kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy tốc độ ST của chủng nghiên cứu không có sự khác biệt lớn thể hiện qua mật độ TB (OD620) ở các nghiệm thức chênh lệch không đáng kể. Như vậy, chủng nghiên cứu có khả năng sử dụng được nhiều nguồn C khác nhau để ST và PT. Trong số các nguồn C (glucose, lactose, sucrose, maltose, rỉ đường) được khảo sát, nguồn C là lactose cho mật độ TB cao nhất (OD620=2,475). Trong khi đó, mật độ TB thu được khi sử dụng nguồn C là glucose cũng tương đối cao (OD620=2,410), chênh lệch không đáng kể so với khi sử dụng đường lactose (OD620=2,475). Do vậy, có thể sử dụng đường glucose thay thế cho lactose trong quá trình lên men thu sinh khối TB nhằm làm giảm giá thành khi sản xuất chế phẩm.
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ đường glucose
Qua khảo sát ảnh hưởng của nguồn C đến sự ST của chủng B. amyloliquefaciens Q22, chúng tôi nhận thấy glucose đóng vai trò như nguồn cung cấp C cho quá trình trao đổi vật chất và năng lượng của VSV. Với mục đích xác định nồng độ glucose thích hợp cho sự ST, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng B. amyloliquefaciensQ22 trên MT4 có bổ sung 1, 2, 3, 4 và 5 % glucose, với các điều kiện như đã khảo sát trước. Thu nhận mẫu sau 24 giờ nuôi cấy và xác định mật độ TB (OD620).
Kết quả được thể hiện qua bảng 3.11 và hình 3.7.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự tạo thành sinh khối của
chủng B. amyloliquefaciens Q22
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự tạo thành sinh khối của
chủng B. amyloliquefaciens Q22
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung glucose vào MT nuôi cấy thì sự ST của chủng này tăng lên rõ rệt (OD620=2,578) so với nghiệm thức không bổ sung glucose (OD620=2,014). Có thể nói, glucose là một dưỡng chất cần thiết cho sự ST của chủng nghiên cứu. Kết quả ở bảng 3.11 cũng cho thấy, chủng nghiên cứu ST mạnh nhất ở nồng độ glucose 1%, thể hiện qua mật độ TB đạt cực đại (OD620= 2,578).
STT Nồng độ glucose (%) Mật độ tế bào (OD620nm)
1 0 2,014 ± 0,005 2 1 2,578 ± 0,001 3 2 2,278 ± 0,011 4 3 2,303 ± 0,006 5 4 2,277 ± 0,013 6 5 2,201 ± 0,007
Như vậy, nồng độ glucose tối ưu cho sự tăng sinh khối TB của chủng nghiên cứu là 1%.
3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn N vô cơ
Theo công bố của nhiều tác giả nước ngoài (Priest et al., 1987; Todar, 2008), các nguồn N cung cấp cho VSV nguyên liệu để hình thành nhóm (-NH3) và nhóm (- NH-) trong các phân tử axit amin, nucleotit, các base dị vòng và các hợp chất hóa học có mặt trong nguyên sinh chất. Trong đó, tỉ lệ nguồn N vô cơ và hữu cơ đóng vai trò khởi động cho quá trình tạo sinh khối VSV. Nguồn N vô cơ mà VSV dễ hấp thụ nhất là NH4+ và NH2+ do chúng dễ dàng thâm nhập vào tế bào VSV. Cũng theo đó, một số loài thuộc chi Bacilluscó khả năng sử dụng cả nguồn N vô cơ lẫn N hữu cơ. Trong đó, nguồn N vô cơ thích hợp cho Bacillus thường là các muối nitrat hoặc muối amonium như: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, NH4Cl [40].
Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng sử dụng N vô cơ của chủng B. amyloliquefaciens Q22 từ các muối (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, NH4Cl và so sánh với N hữu cơ của MT4.
Kết quả được thể hiện qua bảng 3.12 và hình 3.8.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nguồn N vô cơ đến sự tạo thành sinh khối của
chủng B. amyloliquefaciens Q22
STT Nguồn N Mật độ tế bào (OD620nm)
1 N hữu cơ (MT4): cao thịt 5g,
peptone 5g 2,537 ± 0,003
2 (NH4)2SO4 2,304 ± 0,014
3 NaNO3 2,320 ± 0,002
4 KNO3 2,332 ± 0,018
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn N vô cơ đến sự tạo thành sinh khối của
chủng B. amyloliquefaciens Q22
Nhận xét: Qua các kết quả khảo sát cho thấy, chủng nghiên cứu có khả năng ST mạnh trên MT không có bổ sung N vô cơ thể hiện qua mật độ TB đạt cực đại (OD620=2,537). Trong khi đó, ở các MT có bổ sung 0,5% N vô cơ thì mật độ TB thu được thấp hơn. Điều này có thể giải thích là do rất nhiều loài Bacillus có thể đồng hóa được N vô cơ nhưng thường ST nhanh hơn khi chỉ có nguồn N hữu cơ (Priest et al., 1987; Todar, 2008). Tuy nhiên, theo nghiên cứu chủng Bacillus G1 và