của chủng nghiên cứu
2.3.17.1. Khảo sát tỉ lệ giống cấy vào MT
- Mục đích: xác định tỉ lệ giống cấy vào MT thích hợp nhất để thu sinh khối TB cao nhất.
- Cách tiến hành:
+ Giống sau khi PT tốt ở ống thạch nghiêng được cấy nhân giống sang bình tam giác (dung tích 100ml) chứa 10ml MT2 với điều kiện: nhiệt độ phòng, pH 7- 7,5, lắc 180 vòng/phút trong 24 giờ.
+ Chuẩn bị các bình tam giác (dung tích 250ml) chứa 50ml MT2, hấp khử trùng ở 1atm/30 phút.
+ Dùng pipetman hút huyền phù VK từ các bình tam giác (dung tích 100ml) cho vào các bình tam giác (dung tích 250ml) đã chuẩn bị với thể tích khác nhau (0,5; 1,0; 1,5; 2,0;…; 5,0ml) tương ứng với các tỉ lệ cấy giống (1; 2; 3;…; 10%). Nuôi mẫu ở nhiệt độ phòng, lắc 180 vòng/phút trong 24 giờ.
+ Sau 24 giờ, lấy dịch sau nuôi cấy đo OD620. Từ giá trị OD620 đo được, dựa vào đường chuẩn suy ra số lượng TB (CFU/ml) ở từng tỉ lệ cấy giống.
- Kiểm tra kết quả: Căn cứ vào số lượng TB trung bình (CFU/ml) ở từng tỉ lệ cấy giống để chọn tỉ lệ cấy giống thích hợp.
2.3.17.2. Lựa chọn MT nuôi cấy thích hợp
- Nuôi cấy VK trong các bình tam giác chứa 50ml các MT2, MT3, MT4, MT5 với tốc độ lắc 180 vòng/phút.
- Kiểm tra ST của chủng Bacillusbằng cách đo mật độ quang OD620. - Chọn MT thích hợp cho sinh khối TB cao nhất.
2.3.17.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon (C)
- Nuôi cấy VK trong các bình tam giác chứa 50ml MT4, thay đường glucose bằng các đường: sucrose (saccharose), lactose, maltose, rỉ đường với tốc độ lắc 180 vòng/phút.
- Kiểm tra ST của chủng Bacillusbằng cách đo mật độ quang OD620. - Chọn nguồn C thích hợp cho sinh khối TB cao nhất.
2.3.17.4. Ảnh hưởng của nồng độ C
- Nuôi cấy VK trong MT theo mục 2.3.17.3, có nồng độ C thích hợp: 1; 2; 3; 4; 5% với tốc độ lắc 180 vòng/phút.
- Kiểm tra ST của chủng Bacillusbằng cách đo mật độ quang OD620. - Chọn nồng độ C thích hợp cho sinh khối TB cao nhất.
2.3.17.5. Ảnh hưởng của nguồn N
- Nuôi cấy VK trong MT theo mục 2.3.17.4 nhưng có bổ sung 0,5% nguồn N vô cơ lần lượt là NH4Cl, NaNO3, KNO3, (NH4)2SO4 với tốc độ lắc 180 vòng/phút. Mẫu ĐC là MT chứa N hữu cơ (không có bổ sung nguồn N vô cơ).
- Kiểm tra ST của chủng Bacillusbằng cách đo mật độ quang OD620. - Chọn nguồn N thích hợp cho sinh khối TBcao nhất.
2.3.17.6. Ảnh hưởng của nồng độ N
- Nuôi cấy VK trong MT theo mục 2.3.17.5, có nồng độ N thích hợp: 1; 2; 3; 4; 5% với tốc độ lắc 180 vòng/phút.
- Kiểm tra ST của chủng Bacillusbằng cách đo mật độ quang OD620. - Chọn nồng độ N thích hợp cho sinh khối TB cao nhất.
2.3.17.7. Ảnh hưởng của pH ban đầu
- Nuôi VK trong MT theo mục 2.3.17.6, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 4.0; 4.5; 5.0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 ; 8,0 với tốc độ lắc 180 vòng/phút.
- Kiểm tra ST của chủng Bacillusbằng cách đo mật độ quang OD620.
- Dựa vào kết quả thu được, xác định pH thích hợp cho quá trình lên men để thu sinh khối TB cao nhất.
2.3.17.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
- Nuôi VK trong MT theo mục 2.3.17.7, pH thích hợp, ở các nhiệt độ: 25, 30, 35, 37, 40, 450C, với tốc độ lắc 180 vòng/phút.
- Dựa vào kết quả thu được, xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men để thu sinh khối TB cao nhất.
2.3.17.9. Nghiên cứu động học của quá trình lên men
Nuôi VK đã tuyển chọn với các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã xác định được. Sau mỗi 4 giờ nuôi cấy, xác định sự biến động về ST bằng cách đo mật độ quang OD620, kiểm tra pH môi trường bằng pH kế, kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn (D-d, cm) với VK kiểm địnhlà E. coli bằng phương pháp khoan lỗ thạch.
Vẽ đồ thị động thái ST và hoạt tính kháng khuẩn của chủng nghiên cứu. Căn cứ vào đồ thị động thái, xác định thời điểm tốt nhất để thu sinh khối TB nhiều nhất với hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.