- Các VK được sử dụng làm probiotic phổ biến nhất là các VK lactic như
Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus. Đây là các VK hiện diện bình thường trong ruột người, động vật và có khá nhiều tài liệu nghiên cứu về tính chất probiotic của chúng. Tuy nhiên, chúng là các VK vi hiếu khí, đòi hỏi điều kiện dinh dưỡng đặc biệt nên việc nuôi cấy gặp nhiều khó khăn và giá thành sản phẩm cao. Bên cạnh đó, các VK này còn khó bảo quản và khả năng chịu đựng thấp trong điều kiện đông khô, sấy phun,...[19], [29].
- Ngoài đặc điểm dễ nuôi cấy, tốc độ PT nhanh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, Bacilluscòn có nhiều đặc tính phù hợp để tạo chế phẩm sinh học như:
Đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng sinh bào tử. Bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohn (1872) khi nghiên cứu về B. subtilis và sau đó được Koch (1875) mô tả khi nghiên cứu về B. anthracis. Một số loài Bacillus thường có khả năng hình thành bào tử trong chu trình PT tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi như: nhiệt độ cao, MT nghèo dinh dưỡng, pH không thích hợp, MT tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi,…Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và PT thành một TB mới có sức sống mạnh mẽ hơn. Vì vậy, nội bào tử được sinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà là cơ chế đảm bảo cho sự sống còn của VK khi trải qua các điều kiện khắc nghiệt [29].
Ở phần lớn VK, trong 1 tế bào chỉ có 1 bào tử và sau khi trưởng thành bào tử được phóng thích ra khỏi TB. Ở bào tử trưởng thành không diễn ra quá trình trao đổi chất (được xem như trạng thái tiềm sinh). Bào tử Bacillus phát triển theo chu kì, trong trạng thái tiềm ẩn, chúng có thể tồn tại trong thời gian rất dài, đến hàng tỷ năm. Ví dụ như bào tử của B. subtilis có thể duy trì khả năng sống đến 200-300 năm (Sonenshein et al., 1993). Bên cạnh đó, bào tử Bacillus còn có tính ổn định cao với nhiệt độ và sự khô hạn. Ví dụ như ở nhiệt độ 1000C, bào tử B. cereus có khả năng chịu được 2 phút, B. subtilis chịu được 180 phút, B. mesentericus chịu được 380 phút (Rosovitz et al., 1998). Còn khả năng đề kháng với tia phóng xạ của bào tử B. mesentericusgấp 36 lần so với TB dinh dưỡng của E. coli, bào tử và tinh thể của B. thuringensiscó độc tố ức chế nhiều loại côn trùng và bệnh than (Todar, 2008) [61].
Các nhà VSV nhanh chóng nhận ra tầm quan trọng của bào tử như là đặc điểm phân loại nổi bật, là cách xác định đơn giản họ Bacillaceae. Có thể nói, đây là đặc điểm rất quan trọng và có liên quan đến việc sản xuất các chế phẩm sinh học probiotic [18].
+ Khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ
Trong quá trình sống, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học cần thiết để thích ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện MT sống. Trong đó, khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như protease, amylase, cellulase, alkaline
phosohatase, cyclodextran, glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, urease,...là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus.
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết peptide (- O – NH -) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn [3].
Có thể nói Bacilluslà một trong số các VSV có khả năng sinh protease nhiều nhất, đặc biệt là protease kiềm tính [17]. Nhờ khả năng bền nhiệt và bền pH nên protease kiềm từ Bacillus có tầm quan trọng lớn trong ngành công nghiệp chất tẩy rửa, sản xuất bột giặt; trong công nghiệp thuộc da; trong thủy phân protein của cá, thịt,…Điển hình là B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, và B. majovensis [17], [20], [47].
Amylaselà một trong những enzyme được quan tâm nghiên cứu sớm và nhiều nhất. Đặc biệt, so với amylase lấy từ động vật và vi nấm thì amylase từ Bacillusbền hơn trong môi trường acid của dạ dày. Vì thế nên amylase từ Bacillusđược sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh [77]. Ngoài ra, chúng còn được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dệt, công nghiệp thực phẩm (sản xuất bia, rượu, giấm, bột ngọt, bánh kẹo, nước trái cây),… Ví dụ như amylase từ B. licheniformis (Haq et al., 2003), B. amyloliquefaciens (Schallmy et al., 2004), B. subtilis (Gupta et al., 2003),
B. globisporus (Bandyopadhya et al., 1993),…
Cellulase là enzyme xúc tác sự phân hủy cellulose thành sản phẩm trung gian là cellubiose và sản phẩm cuối cùng là đường glucose. Trong tự nhiên có nhiều nhóm VSV có khả năng phân hủy cellulose, trong đó vi nấm là nhóm có khả năng phân giải mạnh. Nhiều loài VK cũng có khả năng này nhưng số lượng và thành phần các loại enzyme không đầy đủ, chủ yếu chỉ sinh endoglucanase (Rabinoyich et al., 2002). Riêng Bacillus là loài sinh cellulase khá lớn, chúng chủ yếu được phân lập từ đất vườn-nơi có nguồn xác bã hữu cơ (rơm, rạ, mụn dừa,..) dồi dào. Ví dụ như, cellulase từ B. subtilis (Park et al., 1991), B. pumilus (Christakopoulos), B.
licheniformis, B. circulans AB 16 (Dhillon et al., 2000), B. polymyxa, B. cereus
(Schallmy et al., 2004).
Tóm lại, nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm VK này có thể chuyển hóa các chất khó tiêu (cellulose, tinh bột, protein) thành chất dễ tiêu (axit amin và glucose) góp phần cải thiện dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật nuôi tăng trọng nhanh, đặc biệt là heo con ở giai đoạn sau cai sữa.
Do vậy, có thể nói khả năng sinh enzyme thủy phân các hợp chất hữu cơ là một đặc tính rất cần thiết trong việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo chế phẩm probiotic trong chăn nuôi.
+ Khả năng đối kháng
Như đã trình bày ở phần trên, VSV probiotic có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh thông qua khả năng cạnh tranh vị trí bám dính và khả năng sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn cao.
Cụ thể, một số chủng Bacillusthường cạnh tranh với VSV gây bệnh về nguồn thức ăn, năng lượng, muối khoáng, MT sống,...để làm giảm mật độ VSV gây bệnh và dần dần đẩy lùi được dịch bệnh. Ví dụ, chủng B. subtilis QST 713 là VK di động, ưa khí được Công ty Agra Quest phát hiện và được Cục bảo vệ MT Mỹ (EPA) đánh giá là có hiệu quả đáng kể trong việc phòng chống được nhiều bệnh do VK và nấm gây ra. B. subtilisQST 713 hoạt động bằng cách chiếm bề mặt lá cây và cạnh tranh với các mầm bệnh để giành không gian sống, nhờ đó đã ngăn cản được nhiều bệnh trên cây trà. Nhiều dòng B. subtilis được xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử của nấm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng và muối khoáng,…[40].
Còn khả năng sinh KS của Bacillus đã được các nhà khoa học nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1907, Nicolle là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của
B. subtilis. Đến năm 1974, Dahab và Goorani đã báo cáo có ít nhất 5 loại KS được chiết tách từ B. subtilisnhư: subtilin, bacitracin, bacillin, subtenolin và bacilomycin. Ngoài ra, còn rất nhiều loài Bacillus khác có khả năng tổng hợp KS như: B. amyloliquefaciens sinh subtilisin, B. brevis sinh gramicidin, tyrothricin, B. pumilus
sinh pumilin, B. polymixa sinh colistin, polimycin,…(Todar, 2008). Đặc biệt, các chất này thường không được dùng trong y tế nên không xảy ra hiện tượng nhờn thuốc đối với VSV gây bệnh, riêng bacitraxin là chất KS được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế VK gây bệnh đường ruột và kích thích tiêu hóa cũng như tăng trọng của vật nuôi [20].
+ Khả năng chịu được nồng độ muối cao, chịu axit, chịu kiềm [40]
Nhiều loài Bacillus có khả năng PT tốt trong MT có nồng độ muối khá cao như B. subtilis, B. licheniformis. Chúng thường tồn tại ở MT nước lợ, nước mặn, trong đường ruột của tôm và được coi là VK có lợi cho tôm (Gomez-Gil et al.,
2000). B. racemilacticus và B. coagulans có thể chịu đựng được nồng độ muối mật trên 0,3% (Hyronimus et al., 2000); một vài chủng khác như B. pasteurii, B. seohaeanensis, B. pantothenticus,…có thể ST ở nồng độ NaCl 10% (Todar, 2008, Lee et al., 2006).
Đặc biệt, nhờ khả năng sinh bào tử mà rất nhiều loài Bacillus có khả năng ST và sống sót trong MT acid cũng như trong MT kiềm. Ví dụ như chủng B. cereus
NCTC 2599 có thể PT ở dải pH khá rộng từ 4-10 (Lindsay et al., 2004), chủng B. laevolacticusDSM 6475 có thể PT đến tận mức pH 2-3 mà bình thường các chủng VK khác không thể phát triển được (Hyronimus et al., 2000), B. coagulans, B. acidocalderius, B. polymyxa có thể ST trong MT có độ pH khá thấp từ 4-5 (Warscheid et al., 2003; Todar, 2008). Còn B. alcalophilus và B. pasteuriicó thể ST tốt ở pH 8-11 (Todar, 2008).
Chính nhờ những đặc tính ưu việt nêu trên cùng với khả năng dễ bảo quản ở điều kiện thường, Bacillus được đánh giá là một trong những đối tượng giàu tiềm năng khai thác trong lĩnh vực sản xuất chế phẩm sinh học (Schallmey et al., 2004).
1.2.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacillus
trong chăn nuôi gia súc và gia cầm trong và ngoài nước
Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacilluslà một nguồn gen phong phú, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học,… Đặc biệt là trong chăn nuôi,
con người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc-gia cầm,…Có thể kể đến những nghiên cứu sau đây:
1.2.3.1. Nghiên cứu trong nước
Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [7].
Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm B. subtilis dạng viên, nuôi cấy trên MT đậu tương, cua đồng,…hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống với liều 0,5- 1g/kg thể trọng. Kết quả sau khi sử dụng chế phẩm, heo tăng trọng nhanh.
Năm 1979-1984, Phan Thanh Phượng và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Biolactyl để phòng và trị bệnh đường ruột ở heo.
Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm Coli-subtyl (E.coli và B. subtilis) đã làm giảm tỉ lệ tái phát tiêu chảy ở heo so với phương pháp điều trị bằng KS, kết quả heo tăng trọng tốt.
Năm 1996, Lê Thị Tài sử dụng Biseptol và Biosubtyl kết hợp với Cloramphenicol trong điều trị loạn khuẩn đường ruột ở heo con và chó con. Kết quả ghi nhận được như sau: trên heo con sau cai sữa, tỉ lệ khỏi bệnh khi dùng Biseptol là 80%, Cloramphenicol là 70%, Biosubtyl là 68%, Biseptol + Biosubtyl là 98% và Biosubtyl + Cloramphenicol là 95 %; còn trên chó con, sử dụng Biseptol cho tỉ lệ khỏi bệnh là 80%, Biseptol + Biosubtyl là 95% và Cloramphenicol là 80%.
Năm 1998, Lã Văn Kính đã thử nghiệm probiotic trên gà đẻ cho kết quả sản lượng tăng 5% so với đối chứng không sử dụng probiotic.
Năm 1999, Lưu Thị Uyên sử dụng chế phẩm EM (Effective
Microorganisms) của Nhật Bản trong phòng ngừa và điều trị hội chứng tiêu chảy ở heo, cho thấy số lượng E.colitrong 1g phân giảm từ 31,1 đến 80,95 triệu VK.
Năm 2001, Lê Thị Phượng ghi nhận hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy ở heo con của các chế phẩm sinh học Paciflor (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109
CFU/g) và Pacicoli (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109 CFU/g + các KS: Colistin 4mg + Lincomycin 3mg). Chế phẩm Paciflor bổ sung trong thức ăn heo nái mang thai giai đoạn cuối và liên tục 28 ngày sau khi sinh đã làm giảm số lượng E. coli trong phân heo nái và heo con, giảm tỉ lệ tiêu chảy của heo con theo mẹ; heo con ăn thức ăn có bổ sung Paciflor hoặc Pacicoli thì số lượng E. coli trong phân giảm, giảm tỉ lệ tiêu chảy và cải thiện tăng trọng heo.
Cũng trong năm 2001 này, Phan Ngọc Kính sử dụng chế phẩm EM trong
chăn nuôi heo thịt cho thấy chênh lệch tăng trọng so với đối chứng tăng từ 20-34%, tỉ lệ thịt xẻ tăng 1,3%, tỉ lệ nạc tăng 4,5%.
Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo mẹ với liều 0,8; 1,0 và 1,2 tỷ CFU/kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa.
Cũng trong năm 2002 này, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm VITOM 1.1 và VITOM 3 (do Nga sản xuất, chứa B. subtilis chủng VKPMV-7092-) để phòng, trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà. Qua đó nhận thấy khi dùng VITOM 3 tăng trọng trên heo tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát, còn khi dùng VITOM 1.1 tăng trọng trên gà tăng 11,8%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 99%.
Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử dụng probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con sau cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E. coli thải qua phân, giảm tỉ lệ tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn.
Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi. Kết quả đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng ST vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi.
1.2.3.2. Nghiên cứu ngoài nước
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ B. subtilis để ngăn chặn sự PT và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp.
Flavus, Asp. Paraciticus. Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc dạng lỏng chứa B. subtilischủng IP 5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm. Năm 1962, Guy Albot còn phát hiện B. subtiliscó tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng KS và viêm đại tràng mãn tính. Còn khi trộn thêm với VK lactic, B. subtilis chữa chứng loạn khuẩn rất hiệu quả ở người và vật nuôi.
Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M. (Effective Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS. TeRuo Higa, Trường Đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980. Chế phẩm này được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ MT và đã mang lại hiệu quả khả quan. Cho đến nay, đây là chế phẩm được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP 122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm này được tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng
B. toyoivới liều 106 CFU/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B. licheniformisvới liều 106
và 107 CFU/kg thức ăn. Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều có tỉ lệ tiêu chảy và tình trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng. Ngoài ra, sự tăng trọng và tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng. Trong đó, lô sử dụng 107
CFU B. licheniformis/kg thức ăncho kết quả tốt nhất.
Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu ăn liên tục trong 7 ngày với liều 6 x 106 CFU/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải của
E.coli O157:H7. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E. coli trong phân thấp hơn so với đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn.