Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Thời gian lây nhiễm là khoảng thời gian mẫu mô ựược ngâm trực tiếp trong dịch huyền phù vi khuẩn. Thời gian này vi khuẩn xâm nhiễm vào trong mô qua các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49
lỗ hổng và các vết thương. Thời gian lây nhiễm ắt vi khuẩn chưa kịp xâm nhập vào trong ngược lại thời gian lây nhiễm dài làm giảm sức sống của mô và tăng khả năng nhiễm lại khi nuôi cấy do lượng vi khuẩn xâm nhập vào củ nhiều.
để khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ựến hiệu quả chuyển gen chúng tôi tiến hành thắ nghiệm với các mẫu củ sâm Ngọc Linh ựược ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn OD600=0,5 bổ sung 100 ộM As, trong các khoảng thời gian khác nhau: 10, 15, 30 phút, thu ựược kết quả sau:
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes ựến hiệu quả chuyển gen qua biểu hiện của gen gus
Thời gian Tổng số mẫu Tổng số mẫu bắt màu GUS(+) (%)a
10 90 29 32,2 15 90 38 42,2 30 90 48 53,3 Lsd0,05 1,5 Cv% 5,2 a
GUS+(%) = số mẫu biểu hiện màu gus / tổng số mẫu thắ nghiệm nhuộm X-gluc Kết quả cho thấy khi tăng thời gian lây nhiễm tăng từ 10 phút ựến 30 phút thì tỷ lệ mẫu bắt màu xanh khi nhuộm X-gluc tăng từ 32,2% lên 53,3%.
Thời gian lây nhiễm dài thì vi khuẩn có nhiều thời gian xâm nhập vào mô tế bào do ựó khả năng chuyển gen vào trong tế bào càng lớn. Thời gian lây nhiễm 10 phút thì tỷ lệ mẫu bắt màu thấp nhất ựạt 32,2%, khi tăng thời gian lây nhiễm ựến 30 phút cho tỷ lệ mẫu bắt màu lớn nhất ựạt 53,3%. Như vậy thời gian lây nhiễm càng dài thì hiệu quả chuyển gen vào tế bào thực vật càng cao.
Tuy nhiên thời gian lây nhiễm dài thì càng ảnh hưởng ựến sức sống của mẫu mô, do lượng vi khuẩn xâm nhiễm vào mô càng lớn thì sự phát triển của vi khuẩn sau khi diệt khuẩn mạnh nên tăng khả năng gây chết mẫu. Trái lại, khi thời gian lây nhiễm ngắn, lượng vi khuẩn xâm nhập ắt, làm giảm khả năng chuyển gen. Theo nghiên cứu của Sureerat and Sompong (2012) thì sự biểu hiện của gen gus tăng lên theo thời gian lây nhiễm, ở loài cọ dầu thì sự biểu hiện gen gus ựạt tối ựa 100% khi lây nhiễm 6 giờ, nhiều loài thực vật một lá mầm thì thời gian lây nhiễm hiệu quả chỉ 15 - 30 phút. Ở cây lúa chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ựược
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50
lây nhiễm trong khoảng thời gian từ 15 - 20 phút cho hiệu quả cao (Tripathi et al., 2010). Theo Yadav et al. (2012) thực hiện lây nhiễm lá mầm của cây ựậu xanh (Vigna radiata) với vi khuẩn Agrobacterium ở các mức 10, 15, 20, 30 phút, thời gian lây nhiễm 15 phút cho hiệu quả chuyển gen cao nhất.
Do ựó thời gian lây nhiễm ở 30 phút cho hiệu quả chuyển gen cao ựược chọn ựể tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra thời gian lây nhiễm. a. 10 phút; b. 15 phút; c. 30 phút.