a) ựồng nuôi cấy 24 giờ, b) ựồng nuôi cấy 48 giờ, c) ựồng nuôi cấy 72 giờ.
3.3.1. Chọn lọc các dòng rễ tơ
Sau khi tiến hành các thắ nghiệm ựể tìm ựiều kiện chuyển gen phù hợp vào tế bào củ sâm Ngọc Linh chúng tôi thu nhận ựược nhiều dòng rễ khác nhau. Các dòng rễ tơ phát triển thành 3 dạng hình thái chủ yếu: rễ có hình thái mảnh, mềm không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66
phân nhánh, phát triển theo chiều dài; rễ ngắn, to, phân nhánh mạnh ựan vào nhau tạo thành khối; rễ có kắch thước trung bình, phân nhánh mạnh. Rễ tơ có hình thái khác nhau là do số lượng bản sao ựoạn T-DNA ựược chuyển vào và vị trắ gắn kết với genome thực vật ở mỗi mẫu là khác nhau. Nếu sự hợp nhất của gen chuyển xảy ra ở vùng nguyên nhiễm sắc, gen chuyển vào có thể bị ảnh hưởng bởi các trình tự ựiều hoà ở phắa ựầu gen, tương tác giữa các gen và ngược lại nếu gen chuyển ựược chèn vào vùng dị nhiễm sắc gen chuyển vào có thể bị bất hoạt.
Sau khi biến nạp cần xác ựịnh xem gen ựã ựược chuyển thành công vào trong tế bào thực vật hay chưa bằng cách kiểm tra sự có mặt của ựoạn gen chuyển vào bằng phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệu.
Các dòng rễ tơ thu ựược sau chuyển gen ựược nuôi cấy trên môi trường SH ựặc không bổ sung chất ựiều hòa sinh trưởng, tiến hành sàng lọc, chọn lựa những dòng rễ tơ sinh trưởng tốt, khả năng phân nhánh mạnh. Các dòng này sẽ ựược tách chiết DNA tổng số ựể phục vụ cho phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của các gen rol.
PCR phương pháp thường ựược dùng trong phân tắch dòng cây chuyển gen vì ựộ tin cậy cao, cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một ựoạn DNA trong một thời gian ngắn. Theo lý thuyết nếu cung cấp cặp mồi ựặc hiệu thì sẽ nhân chắnh xác ựược ựoạn gen nằm giữa cặp mồi ựó. Khi tiến hành phản ứng PCR trên DNA tách từ dòng rễ ựã ựược chuyển gen, nếu cho kết quả ựặc hiệu với cặp mồi ựó thì chứng tỏ rằng dòng rễ tơ ựó ựã mang ựoạn gen cần chuyển.
Hình 3.11. Các dạng hình thái rễ tơ