Cơ chế gây bệnh khối u của vi khuẩn A.tumefaciens và rễ tơ của vi khuẩn
A.rhizogenes là tương tự nhau. Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các polyphenol: acetonsyringone và hydrocyacetonsyringone thu hút các vi khuẩn tập trung vào vùng vết thương, ựồng thời chúng cũng hoạt hóa các gen ở vùng vir hoạt ựộng. Gen của vùng vir có nhiều loại: E, D, C, G, B, A và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chắnh: Cắt ựứt bờ phải và bờ trái ựể giải phóng ựoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với bộ gen của cây chủ một cách an toàn (Bernard et al., 2010).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
Hình 1.5. Cơ chế chuyển T-DNA của Ti-plasmid sang genome thực vật
(http://science.leidenuniv.nl/index.php/ibl/mdg/profile)
để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, ựầu tiên vi khuẩn Agrobacterium phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này ựược thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hoá một protein liên quan ựến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi ựó gen chvA xác ựịnh một protein vận chuyển, ựịnh vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng ựể vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA.
Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein ựó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay ựổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ.
Quá trình chuyển gen chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen
chv quyết ựịnh mà không liên quan ựến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trắ cảm ứng cho các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, ựặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt ựộng như các tắn hiệu nhận biết và khởi ựộng quá trình dẫn truyền.
Sau khi tiếp xúc, protein virA có chức năng như một sensor sẽ nhận biết các phân tử tắn hiệu từ tế bào thực vật. Các tắn hiệu này chắnh là các hợp chất acetonsyringone và hydrocyacetonsyringone do tế bào thực vật bị tổn thương tiết ra. đây là tắn hiệu quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào thực vật. Acetonsyringone (AS) ựược nhận diện bởi protein virA-receptor trên màng vi khuẩn. Protein này có chức năng chuyển phân tử tắn hiệu AS từ vị trắ mô cây bị tổn thương xuyên qua màng tế bào ựể vào tế bào Agrobacterium. Sau khi vào tế bào vi khuẩn AS hoạt ựộng như một nhân tố hoạt hóa gen vùng vir.
Protein virA tự phosphoryl hóa rồi sau ựó phosphoryl hóa protein virG. Các tắn hiệu hóa học này sẽ ựược dẫn truyền từ protein virA sang protein virG. Sản phẩm của protein virG tiếp tục làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại mà hai gen ựược hoạt hóa cuối cùng là virB và virE (Schmulling et al., 1988).
Trước ựó, khi virD ựược hoạt hóa sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết bờ trái và bờ phải của T-DNA và làm ựứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti- plasmid, sản phẩm của gen này sẽ thực hiện quá trình tạo sợi ựơn T-DNA chiều 3Ỗ ựến 5Ỗ (ss T-DNA) từ sợi kép ban ựầu. Hai protein virD1 và virD2 nhận biết hai trình tự 25 kb ựặc hiệu tại bờ trái (LB) và bờ phải (RB), sau ựó ựoạn T-DNA ựơn ựược cắt ra khỏi sợi kép. Quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay ựổi thẩm suất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. đoạn ss T- DNA sẽ ựược bảo vệ, bao bọc chặt chẽ bởi protein virE khỏi sự phân giải bởi các nuclease nội bào. Tiếp ựến phức hợp ss T-DNA sẽ ựược ựưa sang tế bào thực vật thông qua kênh vận chuyển ựược tạo bởi các protein virB, có khoảng 11 loại protein ựược mã hóa bởi gen virB. Khi T- DNA ựã ựược chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật ựược ổn ựịnh và di truyền như các gen bình thường khác (Bernard et al., 2010).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
DNA vào genome tế bào thực vật. Hai protein virE2 và virD2 có chức năng quan trọng trong quá trình gắn kết. Protein virE2 là một loại protein bám sợi ựơn có chức năng bao bọc bảo vệ ựoạn T-DNA khỏi bị các endonuclease phân hủy. Protein virD2 có chức năng gắn kết T-DNA vào genome thực vật. Protein virD2 không chỉ phân cắt tạo sợi ựơn mà còn có chức năng như một enzym nối, nối ựầu 5Ỗ của T-DNA vào ựầu kết thúc 3Ỗ của genome tế bào chủ tại vị trắ ngẫu nhiên (Benoit et al., 2008). Trong quá trình chèn, một số ựoạn DNA ngắn của tế bào thực vật bị mất, các biên của T-DNA xuất hiện sự tương ựồng với DNA thực vật tại vị trắ chèn (Bernard et al., 2010). Giai ựoạn gắn kết là giai ựoạn cuối cùng của quá trình biến nạp và cần các protein của tế bào chủ tham gia vào quá trình chuyển ựoạn T-DNA từ dạng sợi ựơn trở về dạng sợi kép và tồn tại trong genome thực vật (Chilton and Qiudeng Que, 2003).
Sau khi chuyển gen vào tế bào thực vật, sự tương tác giữa các gen với nhau sẽ ảnh hưởng tới kiểu hình của rễ tơ. Hình thái rễ tơ khác nhau sau khi chuyển gen có thể là do khả năng chuyển các ựoạn gen khác nhau trên T-DNA vào các vị trắ khác nhau trên nhiễm sắc thể. Nếu sự hợp nhất của gen chuyển xảy ra ở vùng tắch cực dịch mã kết quả biểu hiện gen có thể bị ảnh hưởng bởi các trình tự ựiều hòa ở phắa ựầu gen và ngược lại nếu gen chuyển ựược chèn vào vùng dị nhiễm sắc thì gen chuyển có thể bị bất hoạt. Ngoài ra còn có một số yếu tố khác ảnh hưởng ựến sự biểu hiện gen như tương tác gen, sự sắp xếp lại gen, số bản sao của gen....
để nghiên cứu ựoạn T-DNA ựược chuyển vào người ta ựã sử dụng gen chỉ thị gus ựể làm sáng tỏ sự biểu hiện của các gen trong từng loại mô và giai ựoạn phát triển (Britton et al., 2008).