Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.4.Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Thời gian ựồng nuôi cấy là khoảng thời gian vi khuẩn ựã bám vào mẫu mô và tăng sinh về số lượng, ựược ựặt trên môi trường ựồng nuôi cấy, môi trường này chứa các chất cần thiết cho mô, tế bào thực.
Nếu thời gian ựồng nuôi cấy quá ngắn thì quá trình biến nạp có thể không hoàn toàn, trong khi ựó thời gian ựồng nuôi cấy dài có thể ảnh hưởng không tốt ựến quá trình biến nạp do vi khuẩn sẽ xâm nhập vào mô nhiều làm khó diệt khuẩn mẫu dễ bị nhiễm lại và chết. Chắnh vì vậy cần tìm ra thời gian ựồng nuôi cấy phù hợp ựể ựạt hiệu quả chuyển gen cao nhất.
để ựánh giá ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy vật sinh trưởng. đây là giai ựoạn chuyển ựoạn T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào bộ gen của thực vật ựến hiệu quả chuyển gen các mẫu củ sâm Ngọc Linh sau khi lây nhiễm với dịch huyền phù vi khuẩn OD600=0,4 trong thời gian 30 phút ựược ựồng nuôi cấy trong tối trên môi trường SH ở các khoảng thời gian 24, 48, 72 giờ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus
Thời gian Tổng số mẫu Tổng số mẫu bắt màu GUS(+) (%)a
24 90 24 26,7 48 90 43 47,8 72 90 49 54,4 Lsd0,05 0,8 Cv% 2,6 a
GUS+(%) = số mẫu biểu hiện màu gus/tổng số mẫu thắ nghiệm nhuộm X-gluc Qua bảng số liệu trên ta thấy thời gian ựồng nuôi cấy ngắn, vi khuẩn xâm nhập ắt nên khả năng chuyển nạp gen vào tế bào thấp nên tỷ lệ mẫu bắt màu thấp. Thời gian ựồng nuôi cấy dài vi khuẩn xâm nhập vào mô nhiều nên tăng khả năng chuyển gen vào tế bào. Sau thời gian ựồng nuôi cấy 24 giờ xung quanh mẫu có vòng khuẩn mờ, có tỷ lệ mẫu bắt màu ựạt 26,7%, ở thời gian ựồng nuôi cấy 48 giờ tỷ lệ mẫu bắt màu ựạt 47,8%. đồng nuôi cấy ở ựiều kiện 72 giờ cho tỷ lệ mẫu biểu hiện gus cao nhất lên ựến 54,4%, tuy nhiên sau ựồng nuôi cấy ở 72 giờ, vòng khuẩn phát triển mạnh xung quanh các lát cắt củ, vi khuẩn phát triển mạnh mẽ trong quá trình ựồng nuôi cấy khiến cho sức sống của mẫu giảm và khả năng mẫu nhiễm lại cao do vi khuẩn xâm nhập sâu vào trong mẫu. Do vậy trong thắ nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ cần ựánh giá khả năng tái sinh của mẫu ựể lựa chọn ựược thời gian ựồng nuôi cấy phù hợp nhất.
Nghiên cứu về chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium trên cây cọ dầu của Sureerat and Sompong (2012) cho thấy thời gian ựồng nuôi cấy hiệu quả là 3 ngày, thời gian ựồng nuôi cấy trong thời gian dài từ 5 - 6 ngày làm giảm khả năng chuyển gen và làm vi khuẩn phát sinh mạnh, giảm khả năng phục hồi của tế bào. Tương tự trên cây lúa, dứa, ựậu xanh thời gian ựồng nuôi cấy 3 ngày với vi khuẩn Agrobacterium cho hiệu quả cao nhất. Trên cây Brassica napus và
Brassica rapa thì thời gian ựồng nuôi cấy 72 giờ với vi khuẩn Agrobacterium thì tỷ lệ mẫu bắt màu cao hơn so với ựồng nuôi cấy 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ (Khan et al., 2009). Khi nghiên cứu thời gian ựồng nuôi cấy trên cây ựậu xanh thì thu ựược kết quả ựồng nuôi cấy 3 ngày cho tỷ lệ biểu hiện gen gus cao nhất, tiếp tục tăng thời gian ựồng nuôi cấy thì hiệu quả chuyển gen giảm do vi khuẩn phát triển quá mức (Yadav et al., 2012).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52
Do ựó, chúng tôi lựa chọn ựồng nuôi cấy ở 72 giờ với tỷ lệ biểu hiện gus
54,4% sử dụng cho các thắ nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng thời gian ựồng nuôi cấy, a) ựồng nuôi cấy 24 giờ, b) ựồng nuôi cấy 48 giờ, c) ựồng nuôi cấy 72 giờ.