Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
2.5.1. Tiến hành với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 chứa gen gusA
chứa gen gusA
để khảo sát khả năng chuyển gen và tìm ra quy trình chuyển gen vào sâm Ngọc Linh.
Lượng mẫu: 90 mẫu/công thức.
Thắ nghiệm 1: Ảnh hưởng của nguồn mẫu ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn
A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus.
Công
thức Nguồn mẫu Ghi chú
1 Mẫu lá Sử dụng chủng vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 có mang
vectơ pTN289. Mẫu lá cây in vitro ựược cắt thành các ựoạn có kắch thước 0,5 x 0,5 cm, cuống lá ựược cắt thành ựoạn 1cm, củ ựược tạo tổn thương sau ựó cắt thành lát có ựộ dày 0,1 - 0,15 cm chuyển vào ựĩa petri. Lây nhiễm trong 15 - 20 phút, giá trị OD600 0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ. Sau ựó nhuộm X-gluc ựể kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen gusA.
Callus ựược tạo từ mô lá, callus 10 tuần tuổi ựược sử dụng ựể biến nạp.
2 Cuống lá
3 Callus
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng ựộ chất cảm ứng acetonsyringone ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus.
Công thức Nồng ựộ AS
(ộM) Ghi chú
1 0 Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 1, chủng vi
khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 có mang vectơ pTN289. Lây nhiễm trong 15 - 20 phút, giá trị OD600
0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ. Sau ựó nhuộm X-gluc ựể kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen gusA.
2 50
3 100
4 200
5 300
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 3: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes ựến hiệu quả chuyển gen qua biểu hiện của gen gus.
Công thức Thời gian
lây nhiễm (phút) Ghi chú
1 10 Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 1, chủng vi
khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 có mang vectơ pTN289. Bổ sung nồng ựộ AS tốt nhất từ thắ nghiệm 2, giá trị OD600 0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ. Sau ựó nhuộm X-gluc ựể kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen gusA.
2 15
3 30
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus.
Công thức Thời gian
đồng nuôi cấy (giờ) Ghi chú
1 24 Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 1, chủng vi
khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 có mang vectơ pTN289. Bổ sung nồng ựộ AS tốt nhất từ thắ nghiệm 2, lây nhiễm trong thời gian tối ưu ở thắ nghiệm 3, giá trị OD600 0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối theo công thức. Sau ựó nhuộm X-gluc ựể kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen gusA.
2 48
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 5: Ảnh hưởng của mật ựộ vi khuẩn A. rhizogenes ựến hiệu quả chuyển gen qua biểu hiện của gen gus.
Công thức OD600 Ghi chú
1 0,25 Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 1, chủng vi khuẩn
A.rhizogenes ATCC 15834 có mang vectơ pTN289. Bổ sung nồng ựộ AS tốt nhất từ thắ nghiệm 2, lây nhiễm trong thời gian tối ưu ở thắ nghiệm 3, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối theo công thức tốt nhất. Sau ựó nhuộm X-gluc ựể kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen gusA.
2 0,5
3 0,75
4 1,0
Thắ nghiệm 6: Ảnh hưởng của tổ hợp các ựiều kiện tối ưu ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus.
Lần lặp lại Ghi chú
1 Sử dụng loại vật liệu tốt nhất từ thắ nghiệm 1 và các ựiều kiện tối ưu ở các thắ nghiệm. Sau ựó nhuộm X-gluc ựể kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen gusA.
2 3