Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
2.5.5. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen gus
Gen gusA gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β- glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm ựặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường
Mẫu thân, lá, củ, mô sẹo
Nuôi lỏng 12 giờ
Chủng gốc A.rhizogenes ATCC 15834
Nuôi ựặc 2 ngày
Nuôi tăng sinh 4-6 giờ
Ly tâm thu sinh khối, tạo huyền phù với SH lỏng Mẫu sâm ựược cắt thành mảnh nhỏ,
gây tổn thương bằng ựầu kim tiêm
Lây nhiễm
Thấm khô, ựồng nuôi cấy trên môi trường SH
Rửa khuẩn, ựặt lên môi trường diệt khuẩn SH bổ sung kháng sinh diệt khuẩn
Tách dòng rễ tơ sang các ựĩa riêng biệt
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
dùng nhất trong phản ứng ựể nhận biết sự tồn tại của gen gusA là X-Gluc (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác ựộng của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm rất ựặc trưng (Lê Văn Hoàng, 2008).
Kiểm tra sự có mặt của gen gus trong cây theo phương pháp nhuộm tế bào học của Jefferson và ựồng tác giả (1987). Các mẫu chuyển gen ựược ngâm trong dung dịch ựệm cơ chất X-Gluc. Sau 24 - 48 giờ mẫu nhuộm ựược tẩy hết diệp lục bằng ethanol 70% và quan sát trên kắnh lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt ựộng của gen gus
sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu ựặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.
ỚPha dịch nhuộm:
Tris/NaCl: Cân 1,21 g Tris và 2,92 g NaCl cho vào 1 lắt SDW, chuẩn pH=7,2 bằng HCl. Khử trùng, bảo quản ở nhiệt ựộ phòng.
X-gluc: Hòa tan 100 mg X-gluc trong 10 ml DMF. Bảo quản trong ống effendof, bọc giấy bạc, bảo quản ở -200C.
Triton X-100: Cho 5 ml triton X-100 vào 45 ml SDW lắc ựều ựến khi tan, bảo quản ở nhiệt ựộ phòng.
1 ml dung dịch nhuộm gồm: 890 ộl Tris/NaCl, 100 ộl X-gluc, 10 ộl Triton X-100.
ỚQuy trình nhuộm
Ủ mẫu với dịch nhuộm X-gluc trong 12 giờ trong tối ở nhiệt ựộ 370C, sau ựó rửa bằng cồn 700 và quan sát dưới kắnh hiển vi. Những vùng có gen gus có màu xanh chàm ựặc trưng.