Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
2.5.2. Tiến hành chuyển gen vào sâm Ngọc Linh với chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 ựể kiểm tra lại quy trình và cảm ứng ra rễ.
rhizogenes ATCC15834 ựể kiểm tra lại quy trình và cảm ứng ra rễ.
Lượng mẫu: 250 - 300 mẫu/công thức.
Thắ nghiệm 7: Ảnh hưởng của nguồn mẫu ựến khả năng tạo rễ tơ.
Công thức Nguồn mẫu Ghi chú
1 Mẫu lá Sử dụng chủng vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834. Mẫu
lá cây in vitro ựược cắt thành các ựoạn có kắch thước 0,5 x 0,5 cm, cuống lá ựược cắt thành ựoạn 1cm, củ ựược tạo tổn thương sau ựó cắt thành lát có ựộ dày 0,1 - 0,15 cm chuyển vào ựĩa petri. Callus ựược tạo từ mô lá, callus 10 tuần tuổi ựược sử dụng ựể biến nạp. Lây nhiễm trong 15- 20 phút, giá trị OD600 0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ. Mẫu sau khi rửa ựược nuôi trên môi trường SH ựặc bổ sung kháng sinh cefotaxime (500 mg/l). Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2 - 6 tuần nuôi ở nhiệt ựộ 22oC và ựiều kiện tối.
2 Cuống lá
3 Callus
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 8: Ảnh hưởng của nồng ựộ chất cảm ứng acetonsyringone (AS) ựến khả năng tạo rễ tơ.
Công thức Nồng ựộ AS
(ộM) Ghi chú
1 0 Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 7, chủng vi
khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834. Lây nhiễm trong 15 - 20 phút, giá trị OD600 0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ. Mẫu sau khi rửa ựược nuôi trên môi trường SH ựặc bổ sung kháng sinh cefotaxime (500 mg/l). Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2 - 6 tuần nuôi ở nhiệt ựộ 22oC và ựiều kiện tối.
2 50
3 100
4 200
5 300
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 9: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes khả năng tạo rễ tơ. Công thức Thời gian lây nhiễm (phút) Ghi chú 1 10
Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 7, chủng vi khuẩn
A.rhizogenes ATCC 15834. Bổ sung nồng ựộ AS tốt nhất từ thắ nghiệm 8, giá trị OD600 0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ. Mẫu sau khi rửa ựược nuôi trên môi trường SH ựặc bổ sung kháng sinh cefotaxime (500 mg/l). Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2 - 6 tuần nuôi ở nhiệt ựộ 22oC và ựiều kiện tối.
2 15
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 10: Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến khả năng tạo rễ tơ. Công thức Thời gian đồng nuôi cấy (giờ) Ghi chú 1 24
Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 7, chủng vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834. Bổ sung nồng ựộ AS tốt nhất từ thắ nghiệm 8, lây nhiễm trong thời gian tối ưu ở thắ nghiệm 9, giá trị OD600 0,3-0,6, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối theo công thức. Mẫu sau khi rửa ựược nuôi trên môi trường SH ựặc bổ sung kháng sinh cefotaxime (500 mg/l). Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2 - 6 tuần nuôi ở nhiệt ựộ 22oC và ựiều kiện tối.
2 48
3 72
Từ kết quả thắ nghiệm trên rút ra công thức tốt nhất làm thắ nghiệm tiếp theo.
Thắ nghiệm 11: Ảnh hưởng của mật ựộ vi khuẩn A. rhizogenes ựến khả năng tạo rễ tơ.
Công thức OD600 Ghi chú
1 0,25 Sử dụng loại mẫu tốt nhất ở thắ nghiệm 7, chủng vi khuẩn
A.rhizogenes ATCC 15834. Bổ sung nồng ựộ AS tốt nhất từ thắ nghiệm 8, lây nhiễm trong thời gian tối ưu ở thắ nghiệm 9, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối theo công thức tốt nhất. Mẫu sau khi rửa ựược nuôi trên môi trường SH ựặc bổ sung kháng sinh cefotaxime (500 mg/l). Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2 - 6 tuần nuôi ở nhiệt ựộ 22oC và ựiều kiện tối.
2 0,5
3 0,75
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Thắ nghiệm 12: Ảnh hưởng của tổ hợp các ựiều kiện tối ưu ựến khả năng tạo rễ tơ.
Lần lặp lại Ghi chú
1 Sử dụng loại vật liệu tốt nhất từ thắ nghiệm 8 và các ựiều kiện tối ưu ở các thắ nghiệm. Mẫu sau khi rửa ựược nuôi trên môi trường SH ựặc bổ sung kháng sinh cefotaxime (500 mg/l). Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2 - 6 tuần nuôi ở nhiệt ựộ 22oC và ựiều kiện tối.
2 3
Thắ nghiệm 13: Kiểm tra sự có mặt của các gen rol
Các dòng rễ tơ thu ựược sau chuyển gen ựược nuôi cấy trên môi trường SH ựặc không bổ sung chất ựiều hòa sinh trưởng, tiến hành sàng lọc, chọn lựa những dòng rễ tơ sinh trưởng tốt, khả năng phân nhánh mạnh. Các dòng này sẽ ựược tách chiết DNA tổng số ựể phục vụ cho phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của các gen rol.
Thắ nghiệm 14: Xác ựịnh môi trường nuôi cấy các dòng rễ tơ * Ảnh hưởng của nước dừa tới sinh trưởng của rễ tơ
Công thức Thành phần
môi trường Ghi chú
1 SH Môi trường không bổ sung chất ựiều hòa sinh
trưởng. Rễ tơ ựược nuôi trên máy lắc với tốc ựộ 80 vòng/phút trong ựiều kiện 22oC, trong tối.
Sau 3 tuần bổ sung thêm môi trường. Cân rễ sau 6 tuần nuôi cấy.
2 SH+5% nước dừa
3 SH+10% nước dừa
4 SH+15% nước dừa
5 SH+20% nước dừa
* Ảnh hưởng của casamino acid tới sinh trưởng của rễ tơ
Công thức Thành phần
môi trường Ghi chú
1 SH Môi trường không bổ sung chất ựiều hòa sinh
trưởng. Rễ tơ ựược nuôi trên máy lắc với tốc ựộ 80 vòng/phút trong ựiều kiện 22oC, trong tối.
Sau 3 tuần bổ sung thêm môi trường. Cân rễ sau 6 tuần nuôi cấy.
2 SH+100 mg/l
3 SH+250 mg/l
4 SH+500 mg/l
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37