Agrobacterium là các loài vi khuẩn ựất, thuộc nhóm Gram (-), yếm khắ, xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn nay gây bệnh u rễ hay bệnh rễ tơ.
Agrobacterium thuộc: Giới Bacteria
Nghành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Có 4 loài chắnh Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi. Trong ựó hai loài Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes ựược nghiên cứu nhiều nhất.
Hình 1.3. Vi khuẩn Agrobacterium sp, rễ tơ do vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes gây ra
Vi khuẩn ựất gram âm A.rhizogenes, gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm. Giống như vi khuẩn A.tumefaciens mang Ti-plasmid, A.rhizogenes mang Ri (root- inducing) plasmid, là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17
nhiễm (Chilton and Tepfer, 1982). Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của hai vi khuẩn này ựược chứng minh là tương tự nhau (Sevon and Oksman, 2002).
Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt ựầu hoạt ựộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine là sản phẩm ngưng kết giữa một acid và keto acid amin hoặc với ựường, ựược vi khuẩn sử dụng như một loại Ộthức ănỢ nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes ựối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay ựổi hình thái chắnh của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh (Cardarelli and Spanò, 1987; Sevon and Oksman, 2002).
Hình 1.4. Cấu trúc Ri- plasmid
Cấu trúc của Ri-plasmid và Ti-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử lớn từ 200 - 800 kb gồm 4 vùng cơ bản: vùng khởi ựầu sao chép (ORI), vùng mang cấu trúc gen ựộc (vir), vùng T-DNA và vùng gen phân giải opine. Vùng T-DNA và vùng gen ựộc vir ựóng vai trò quan trọng trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18
B, A. Các enzym này có hai chức năng chắnh là cắt ựứt vùng bờ trái và bờ phải ựể giải phóng ựoạn T-DNA, chức năng thứ hai là bao bọc và vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với bộ gen của thực vật một cách an toàn, tại ựây nó chuyển một ựoạn T-DNA (transfer DNA) từ Ri-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ (Bernard et al., 2010).
T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chắnh là vùng bên trái TL-DNA và bên phải TR-DNA. Hầu hết các gen ựược ựịnh vị bên trong T-DNA chỉ ựược hoạt hóa sau khi chèn vào bộ gen thực vật. Hai vùng này ựều có kắch thước khoảng 15-20 kb và ựược xen kẽ bởi một ựoạn DNA, ựoạn DNA này sẽ không ựược chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ.
Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 và tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung ựọc mở (ORFs), trong ựó có locus 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của các chủng
A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa vùng T- DNA ựơn, có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD (Christey MC, 2001; Britton et al., 2008).
Một số nghiên cứu cho thấy nếu chèn vào một ựoạn gen lạ hay xóa bỏ các gen ở phần TL-DNA có thể làm mất kiểu hình biểu hiện rễ tơ ở cây Kalanchoe diagremontiana. Nếu chỉ có một vùng TR-DNA biểu hiện thì có thể hình thành rễ nhưng sẽ không mạnh bằng ựồng thời cả TL-DNA và TR-DNA kết hợp với nhau (White et al., 1985). điều này cho thấy TL-DNA có vai trò quan trọng trong biểu hiện hình thái rễ ở tế bào thực vật.
Các gen rolA, rolB và rolC ựóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật ựược xác ựịnh là nằm trên vùng TL-DNA. Sự biểu hiện ựồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình thường (Britton et al., 2008). Một số nghiên cứu ựã tách dòng gen rolA và biểu hiện trong cây thuốc lá và ghi nhận ựược sự thay ựổi kiểu hình rõ rệt. Khi biểu hiện gen rolA bằng chắnh promotor nguyên gốc thì cây thuốc lá trở nên còi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
cọc, lá xanh ựậm nhăn nheo, hoa dị dạng, giảm chiều cao và chiều dài lóng thân. Việc biểu hiện gen rolA trong cây thuốc lá là nguyên nhân của trạng thái suy giảm một vài hợp chất ựiều hòa sinh trưởng, trong ựó có nhóm auxin, cytokin, gibberellin và axit abscisic. Sự suy giảm các hooc môn trên phụ thuộc vào từng giai ựoạn phát triển và loại mô (Tomy and Angelo, 1995).
Trong 3 gen rol trên, gen rolB ựóng vai trò quan trọng nhất, gen rolB ựược tìm thấy hầu hết trong các Ri plasmid và gần 60% gen ựã ựược nhận dạng giữa các chủng A.rhizogenes khác nhau. Khi gen rolB ựược biểu hiện, mô tế bào thực vật ựã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi ựó khi bất hoạt gen rolB không tạo ựược kiểu hình rễ tơ. Trong một số loài thực vật chỉ mình gen rolB biểu hiện cũng tạo ra rễ tơ (Britton et al., 2008).
Kết quả cho thấy khi biểu hiện gen rolB bằng chắnh promotor gốc trong cây thuốc lá, sự hình thành cây thuốc lá sẽ thay ựổi bao gồm: sự thay ựổi hình thái lá và hoa và ựặc biệt gia tăng sự hình thành rễ bất ựịnh ở thân cây. Bên cạnh ựó, nhiều nghiên cứu có sự liên quan chặt chẽ giữa gen rolB và auxin. Ở cây cà rốt, nếu chỉ có một mình gen rolB thì không thể hiện kiểu hình rễ tơ, auxin là cần thiết cho việc tạo rễ tơ và có thể ựược cung cấp bởi gen aux-TR-DNA mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp auxin IAA nằm trên vùng TR-DNA (Britton et al., 2008).
Các gen rolC và rolD vẫn ựang ựược nghiên cứu về chức năng trong quá trình tạo rễ tơ. Thực vật mang gen rolC cùng với promotor gốc sẽ bị ngắn, giảm ưu thế ngọn, tạo lá hình mũi mác, ra hoa sớm và nhỏ, số lượng nhị hoa ắt. Cây thấp lùn do kắch thước của tế bào biểu bì trong lóng giảm, số lượng rễ ở những cây ựược chuyển gen rolC có tăng so với nhưng cấy ựối chứng không chuyển gen nhưng lại giảm so với những cây có mặt ựầy ựủ các gen rolA, rolB, rolC, rolD. Khi chuyển gen rolC vào cây thì cây con có khả năng chịu ựựng cao hơn với các hooc môn sinh trưởng như auxin, giberelin và acid abscisic, nhưng tăng nhạy cảm với cytokinin. Chuyển gen rolC vào cây làm thay ựổi nồng ựộ gibberellin vì giảm GA1 và sự gia tăng nồng ựộ GA19 và làm cây bất dục ựực, khi khắc phục bằng GA3 thì khôi phục ựược chiều dài lóng nhưng không khôi phục ựược sự hữu dục (Schmulling et al., 1993). Khi chuyển gen rolC vào cây thuốc lá thì cây có kiểu hình thấp, lá ngắn,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
nhỏ, ra hoa sớm nhỏ giảm khả năng thụ phấn, hạt nhỏ, ắt (Scorza et al., 1994). Gen rolD ựược tìm thấy trên vùng TL-DNA của Ri-plasmid, gen này không có khả năng hình thành rễ tơ khi chuyển một mình nó vào trong cây. Kiểu hình của cây do gen rolD gây ra trên cây thuốc lá là tăng số lượng hoa và giảm số lượng rễ, tuy số lượng hoa tăng nhưng nhị và nhụy chắn không ựều ngăn cản sự tự thụ phấn (Britton et al., 2008).
Khi kết hợp cả ba gen rolA, B, C tạo ra rễ tơ ở cây thuốc lá tuy nhiên khi thể hiện riêng rẽ sẽ tạo ra kiểu hình ựặc biệt của mỗi gen. Mặc dù từng gen có thể hình thành rễ tơ trên cây thuốc lá nhưng khi kết hợp 3 gen thì cho hiệu quả ra rễ cao nhất (Schmulling et al., 1988).
Ngoài các gen sinh tổng hợp auxin và cytokinin ra thì vùng T-DNA còn mang gen tổng hợp opine. đây là sản phẩm ngưng kết giữa một acid và keto acid amin hoặc với ựường. Opine ựược tổng hợp bên trong khối u và ựược tiết ra ngoài,
Agrobacterium sử dụng opine như một nguồn dự trữ cacbon hay nito do ựều có vùng gen phân giải opine trong plasmid. Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ, Ri-plasmid ựược chia làm 2 nhóm chắnh: agropine và mannopine, và một số nhóm phụ ựược tìm thấy và phân loại sau này như cucumonpine và mikimopine. Trong ựó các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TP7, TR101) và các chủng này ựược sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật (Sevon and Oksman, 2002).