Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến khả năng tạo rễ tơ
Thời gian ựồng nuôi cấy là giai ựoạn chuyển ựoạn T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào bộ gen của thực vật. Nếu thời gian ựồng nuôi cấy quá ngắn thì quá trình biến nạp có thể không hoàn toàn, trong khi ựó thời gian ựồng nuôi cấy dài vi khuẩn sẽ xâm nhập vào mô nhiều làm khó diệt khuẩn mẫu dễ bị nhiễm lại và chết. để ựánh giá chắnh xác ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy tới khả năng chuyển gen tạo rễ tơ của vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 chúng tôi tiến hành thắ nghiệm lây nhiễm trong 10 phút, bổ sung AS 100 ộM, giá trị OD600=0,4, ựồng nuôi cấy ở 24, 48, 72 giờ thu ựược tỷ lệ ra rễ sau ựồng nuôi cấy ở bảng sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến khả năng tạo rễ tơ Thời gian Tổng số mẫu Tổng số mẫu ra rễ Tỷ lệ mẫu nhiễm lại(%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 24 277 35 4,07 12,6 48 287 119 5,19 41,5 72 275 45 15,19 16,8 Lsd0,05 1,8 Cv% 3,5
Qua ựây ta thấy thời gian ựồng nuôi cấy khác nhau có ảnh hưởng khác nhau tới tỷ lệ tạo rễ tơ. Nếu ựồng nuôi cấy trong 24 giờ tỷ lệ mẫu bị nhiễm lại sau khi rửa khuẩn thấp chỉ có 4% tuy nhiên tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tơ thấp ựạt 12,6%, chứng tỏ thời gian ựồng nuôi cấy ngắn vi khuẩn chưa ựủ thời gian ựể chuyển gen vào trong tế bào, khi thời gian ựồng nuôi cấy lên ựến 72 giờ vòng khuẩn xung quanh mẫu củ phát triển dày ựặc, có tỷ lệ mẫu ra rễ thấp ựạt 16,8% và tỷ lệ mẫu nhiễm lại cao 15,2% là do vi khuẩn phát triển mạnh và gây chết mẫu dẫn ựến tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ thấp. đồng nuôi cấy ở 48 giờ tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ cao ựạt 41,5%, và tỷ lệ mẫu nhiễm lại cao hơn khi ựồng nuôi cấy 24 giờ nhưng không ựáng kể chỉ chiếm 5%. Fang and Grumet nghiên cứu trên cây dưa vàng năm 1990 khi thời gian ựồng nuôi cấy từ 0 - 3 ngày thì khả năng tái sinh của mô sẹo và chồi sau chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens tăng mạnh, khi kéo dài thời gian ựồng nuôi cấy từ 3 - 7 ngày thì khả năng tái sinh của mẫu sau chuyển gen giảm. Trong thắ nghiệm chuyển gen trên cây ựậu tương Trick and Finer cũng tiến hành ựồng nuôi cấy 2 ngày cho hiệu quả cao (Trick and Finer, 1997). Khi chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào cây Andrographis paniculata tác giả ựã tiến hành ựồng nuôi cấy 2 ngày cho hiệu quả chuyển gen từ 50 - 58% (Sharmila and Subburathinam, 2013).
Như vậy với thời gian ựồng nuôi cấy khác nhau ảnh hưởng tới sự phát triển của mẫu sau diệt khuẩn, nếu thời gian ựồng nuôi cấy dài, khuẩn sẽ mọc nhanh làm mẫu sinh trưởng chậm và chết mẫu. Từ kết quả thu ựược, chúng tôi nhận thấy thời gian ựồng nuôi cấy 48 giờ là phù hợp.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra thời gian ựồng nuôi cấy.