Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
2.5.8. Phương pháp PCR Ờ Polymerase Chain Reaction
Các dòng rễ sau khi tách DNA ựược kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi ựặc hiệu ựể kiểm tra sự có mặt của các gen rol trong các dòng rễ biến nạp.
Trình tự các cặp mồi rol ựược sử dụng ựể ựánh giá hiệu quả biến nạp gen thông qua vi khuẩn A. rhizogenes:
rolC_R 5Ỗ-AAACTTGCACTCGCCATGCC-3Ỗ
đoạn gen rolC/ 0,4 kb
rolC_F 5Ỗ-TGTGACAAGCAGCGATGAGC-3Ỗ
rolB_R 5Ỗ-CGGATCCCCTCGAATAGGTT-3Ỗ
đoạn gen rolB/0,75 kb
rolB_F 5Ỗ-TCAGGTTTACTGCAGCAGGC-3Ỗ
rolA_F 5Ỗ-ACGGTGAGTGTGGTTGTAGG-3Ỗ
đoạn gen rolA/0,5 kb
rolA_R 5Ỗ-GCCACGTGCGTATTAATCCC-3Ỗ
Chuẩn bị máy PCR, các thành phần phản ứng: D N A , 10X PCR buffer, H2O vô khuẩn, mồi xuôi, mồi ngược, dNTPs, Taq polymerase. Riêng dNTPS và Taq polymerase giữ lạnh ựông cho ựến khi sử dụng.
Ký hiệu số thứ tự các dòng rễ trên các ống eppendorf 0,2 ml sử dụng cho phản ứng PCR. Chuẩn bị mỗi phản ứng 25 ộl gồm các thành phần như sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 Thành phần Thể tắch (ộl) H2O ựề ion 9,5 PCR buffer 10X 2,5 dNTPs 2mM 2,5 MgCl2 25 ộM 2,5 DNA 250 ộg 5 Mồi xuôi 10 ộM 1 Mồi ngược 10 ộM 1 Taq polymerase 1U 1
đặt các ống eppendorf 0,2 ml vào máy PCR, chú ý ựặt vào các ô trung tâm ựể nhiệt ựược ựều và ổn ựịnh. Cài ựặt chương trình phản ứng.
Quá trình nhân ựoạn ựược thực hiện qua các bước sau: 94oC/5 phút, 30 chu kỳ lặp lại các bước 94oC/1 phút, 53oC/30 giây, 72oC /1 phút, 72oC/10 phút.
điện di trên gel agarose:
Cân 0,8 g agarose cho vào TAE 1X ựến thể tắch 100ml, ựun sôi ựể agarose tan hoàn toàn. để nguội 45 - 550C, ựổ vào khuôn ựã chuẩn bị trước. Sau 60 phút khi gl ựã nguội và ựông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy ựiện di và cho ựệm chạy TAE 1X vào buồng ựiện di sao cho ngập bản gel khoảng 0,5 - 1 cm
Tra mẫu: sản phẩm PCR ựược trộn với loading dye theo tỷ lệ: Vmẫu : Vdye = 5:1 và tra vào các giếng trên gel.
Chạy ựiện di: điện thế dùng ựể ựiện di từ 90 - 120V. DNA chuyển từ cực âm sang cực dương.
Bản gel ựược lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (10 ộg/ml) trong thời gian 20 phút.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43