Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
2.5.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Khanuza et al., (1999), ựây là phương pháp phổ biến dùng ựể tách chiết DNA tổng số từ thực vật cho hiệu suất tách chiết cao.
Các mẫu sau biến nạp ựược nuôi trên môi trường SH ựặc, sau 30 ngày lựa chọn các dòng rễ trắng, ựầu rễ không bị thâm ựen, sinh trưởng tốt, phân nhánh mạnh ựể nuôi sinh khối trên môi trường SH lỏng. Các ựoạn rễ non ựược mang ựi tách và tinh sạch DNA tổng số. Thành phần ựệm rửa Tris Ờ HCl pH: 8 100 mM EDTA pH: 8 5 mM Sorbitol 0,35 M Na2HPO4 0,4% Thành phần ựệm chiết CTAB 4% NaCl 1,4 M EDTA pH: 8 20 mM Tris Ờ HCl pH: 8 100 mM Quy trình
Cân 0,1 g mẫu rễ, thấm khô cho vào ống eppendorf 2 ml. Nghiền nhanh trong nito lỏng, nghiền tạo thành dạng bột mịn.
Bổ sung 1 ml ựệm rửa, lắc ựều trong 40 giây. Sau ựó ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC, loại dịch nổi, thu cặn tủa. Lặp lại bước rửa mẫu từ 2 ựến 3 lần nếu mẫu vẫn còn bẩn.
Bổ sung 800 ộl ựệm chiết, ựảo nhẹ, ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở 65oC trong 30 phút ựến 60 phút, cứ 15 - 20 phút ựảo nhẹ 1 lần.
Bổ sung 800 ộl dịch C:I (Chloroform : Isoamyl, tỷ lệ 24 : 1) ựảo nhẹ trong 10 phút.
Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Sau khi ly tâm, dịch trong ống eppendorf phân tách thành 3 lớp. Dùng pipet hút nhẹ lớp dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới, khoảng 500 ộl. Chú ý, hút nhẹ nhàng, tránh hút phải lớp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
cặn bẩn ở dưới.
Bổ sung vào ống eppendorf 1,5 ml 500 ộl Isopropanol lạnh, ựảo nhẹ, giữ trong -20oC trong 30 ựến 60 phút ựể tủa DNA.
Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC, loại dịch nổi, thu DNA tổng số. Thực hiện rửa DNA bằng cồn 70o lạnh, ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC, thu cặn tủa sau ựó làm khô DNA ở nhiệt ựộ phòng.
Hòa tan cặn DNA với 50 ộl H2O deion bổ sung Rnase nồng ựộ 100 mg/ộl. Sau ựó ựiện di kiểm tra tren gel agarose 0,8 %.