Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes
Loại mô thực vật là một yếu tố quan trọng trong quá trình chuyển gen. Khả năng chuyển gen phần lớn phụ thuộc vào loại mẫu biến nạp. Do ựặc tắnh sinh lý khác nhau của mỗi loại mẫu nên khả năng nhận gen và khả năng ra rễ của từng loại mẫu khác nhau là khác nhau.
Một số nghiên cứu trước ựây cho thấy rằng loại mô và tuổi của mẫu cấy có ảnh hưởng lớn ựến sự cảm ứng hình thành rễ tơ. Loại mẫu và tuổi mẫu là yếu tố chắnh dẫn ựến sự khác biệt về ựặc tắnh sinh lý của tế bào (Dupre et al. 2000).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45
vật liệu thắch hợp nhất ựể tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo. Theo nghiên cứu của Piqueras et al. (2010) với những cây thân thảo nguồn mẫu lá, mô sẹo, phôi non, thân mầm, lá mầm, cuống lá, củ cho hiệu quả chuyển gen cao.
Trong thắ nghiệm này chúng tôi khảo sát khả năng nhận gen chuyển của các nguồn mẫu: mẫu lá, cuống lá, mô sẹo và mẫu củ in vitro, sau khi tạo tổn thương, ngâm trong dịch vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 có mang vectơ pTN289 trong 15 - 20 phút, giá trị OD600 ựo ựược là 0,4, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ. Sau ựó tiến hành nhuộm X-gluc ựể kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen gusA.
Trong vector pTN289 có gen chỉ thị gusA. Gen gusA mã hoá cho việc tổng hợp enzym β-glucuronidase, xúc tác phân giải nhiều loại β-D-glucuronide. Hoạt tắnh gus trong mô thực vật biến nạp có thể ựược xác ựịnh bằng sự có mặt của màu xanh chàm ựặc trưng dễ nhận biết ựược tạo thành sau khi thuỷ phân cơ chất X-Gluc. để kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA trong các mẫu ựã lây nhiễm, chúng tôi thu các mẫu thực vật ựược diệt vi khuẩn sau thời gian ựồng nuôi cấy ngâm với dung dịch X-gluc 12 giờ ở 370C trong tối. Mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm ựặc trưng.
Kết quả nghiên cứu ựược thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn A.
rhizogenes qua biểu hiện của gen gus
Nguồn mẫu Tổng số mẫu Tổng số mẫu
bắt màu GUS(+) (%) a Lá 90 40 44,4 Cuống lá 90 38 42,2 Củ 90 27 30,0 Mô sẹo 90 35 38,9 Lsd0,05 1,5 Cv% 4,8 a
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Kết quả sau khi tiến hành nhuộm X-gluc cho thấy tất cả các loại mô ựều bắt màu. Tỷ lệ biểu hiện gen gus ở các nguồn mẫu là khác nhau, biểu hiện gen gus thấp nhất là 30% ở nguồn vật liệu là củ, biểu hiện gen gus cao nhất ở mẫu lá ựạt 44,4%, với nguồn vật liệu cuống lá với tỷ lệ 42,2% sau ựó là mô sẹo với tỷ lệ 38,9%. Khi chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium thì nguồn vật liệu mô sẹo có khả năng nhận gen cao ựược sử dụng làm vật liệu chuyển gen ở cây lúa nhờ với mô sẹo 35 ngày tuổi cho tỷ lệ nhận gen cao nhất (Tripathi et al., 2010), ở cây sâm Hàn Quốc (Panax ginseng) khi chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium nguồn vật liệu là mô sẹo cũng cho hiệu quả cao nhất (Choi et al., 2003).
Ta thấy khả năng nhận gen của thân và lá cao hơn so với mẫu củ và mô sẹo. Mẫu củ có khả năng nhận gen thấp nhất là do thành tế bào dày hơn ở các mô khác nên khả năng chuyển gen của vi khuẩn vào trong thấp hơn.
Mẫu cuống lá và lá có khả năng nhận gen cao nhưng khi quan sát ở tuần thứ 4 - 5 thì mẫu cuống lá và lá có dấu hiệu chết do vậy khi tiến hành thắ nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ sau thời gian ựồng nuôi cấy dài hai nguồn vật liệu này có thể bị chết nên tỷ lệ mẫu hình thành nên rễ tơ thấp. Mô sẹo có khả năng nhận gen cao hơn mẫu củ nhưng mất thời gian tạo mô sẹo, hàm lượng auxin trong mô sẹo cao ảnh hưởng ựến tỷ lệ ra rễ nên không ựánh giá chắnh xác ựược tác ựộng của các yếu tố ựến sự hình thành rễ, mặt khác mẫu mô sẹo có nhiều khe, kẽ cho vi khuẩn trú ngụ dẫn ựến tỷ lệ mẫu nhiễm lại cao. Do vậy củ sâm có khả năng nhận gen khá cao (30%), ựược chọn làm nguồn vật liệu cho các thắ nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1: Kết quả thử vật liệu chuyển gen. a. cuống lá, b. mẫu lá, c. mô sẹo, d. củ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47