Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng ựộ chất cảm ứng acetonsyringone (AS) ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Thành phần môi trường nhiễm khuẩn là một yếu tố có ảnh hưởng lớn ựến hiệu quả của quá trình biến nạp. Môi trường gây nhiễm phải vừa ựảm bảo sức sống cho vi khuẩn và cả cho mẫu thực vật. Khi cây bị thương tiết ra các chất có bản chất phenol acetosyringone và hydrocyacetosyringone. Các chất này thu hút vi khuẩn vào vùng vết thương ựồng thời chúng cũng hoạt hóa các gen ở vùng vir của plasmid hoạt ựộng và tăng khả năng chuyển gen vào tế bào (Stachel et al., 1985). Chắnh vì vậy cần nghiên cứu ựể sử dụng AS ở nồng ựộ nào cho thắch hợp ựể ựạt hiệu quả cao nhất.
Ở thắ nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của AS ở các nồng ựộ 0, 50, 100, 200, 300 ộM. Các lát cắt củ sâm Ngọc Linh ựược ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có giá trị OD600 là 0,4 trong 15 - 20 phút, sau thời gian ựồng nuôi cấy tiến hành nhuộm X-gluc và thu ựược kết quả sau:
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng ựộ chất cảm ứng acetonsyringone ựến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus
Nồng ựộ AS
(ộM) Tổng số mẫu Tổng số mẫu bắt màu GUS(+) (%)
a 0 90 26 28,9 50 90 30 33,3 100 90 44 48,9 200 90 42 46,7 300 90 41 45,6 Lsd0,05 1,4 Cv% 4,4 a
GUS+(%) = số mẫu biểu hiện màu gus / tổng số mẫu thắ nghiệm nhuộm X-gluc Từ kết quả thắ nghiệm cho thấy khi bổ sung AS giúp nâng cao hiệu quả biến nạp khi tăng nồng ựộ AS từ 0 - 100 ộM thì khả năng biến nạp gen của vi khuẩn vào tế bào thực vật tăng mạnh từ 28,9 - 48,9%, khi tăng nồng ựộ AS từ 100 - 300 ộM thì tỷ lệ mẫu bắt màu của mẫu giảm từ 48,9 xuống 45,6%. Chứng tỏ khi bổ sung AS ở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48
nồng ựộ thắch hợp thì có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn vào mô thực vật nhiều hơn, những tế bào ở bên trong cũng có khả năng tiếp xúc với vi khuẩn nên khả năng chuyển gen từ vi khuẩn vào tế bào thực vật cao hơn.
Khi tăng nồng ựộ AS từ 0 - 100 ộM tỷ lệ bắt màu của mẫu tăng là do khi ở nồng ựộ vừa phải AS có tác dụng dẫn dụ một lượng vi khuẩn vừa ựủ vào tiếp xúc với các tế bào, khi ựó vi khuẩn có ựiều kiện chuyển ựoạn T-DNA vào tế bào thực vật. Khi nồng ựộ AS lớn từ 100 - 300 ộM thu hút nhiều vi khuẩn vào mô thực vật, tuy nhiên với lượng mẫu nhất ựịnh thì cũng cần lượng vi khuẩn nhất ựịnh ựể tiếp xúc với nhiều tế bào nhất và chuyển gen vào bộ gen của tế bào, khi mật ựộ vi khuẩn tăng quá cao gây tổn thương tế bào thực vật nên không làm tăng khả năng chuyển gen vào thực vật. Vì vậy khi tăng nồng ựộ AS từ 100 - 300 ộM không tăng hiệu quả chuyển gen.
Kết quả này cũng tương tự như trong nghiên cứu của Qing Zhao et al. (2010) khi bổ sung AS từ 0 - 100 ộM thì khả năng tái sinh của cây Hồng môn (Anthurium andraeanum) sau chuyển gen tăng từ 0,64% - 3,31%, khi tăng nồng ựộ AS lên 125 ộM thì khả năng tái sinh tăng lên nhưng không ựáng kể. Ở cây lúa mì nồng ựộ AS 50 ộM cho hiệu quả chuyển gen cao nhất (Hamid et al., 2011). Ở cây lúa thì nồng ựộ AS cho hiệu quả tối ựa là 350 ộM (Tripathi et al., 2010).
Từ kết quả trên ta thấy nồng ựộ AS thắch hợp là 100 ộM.
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra nồng ựộ AS a, b, c, d lần lượt: 0, 50, 100, 200, 300 ộM