5. Những đóng góp mới của luận án
3.1.2. Giai đoạn tạo sự phát sinh hình thái và nhân nhanh
Để nhân nhanh chồi in vitro, trong giai đoạn đầu cần phải điều khiển mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi để tăng lượng mẫu sạch. Môi trường nuôi cấy, ngoài các chất dinh dưỡng cần thiết, cần phải bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin...
BA có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, tái sinh chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy và hạn chế sự phát triển rễ. α-NAA có tác dụng kích thích sinh trưởng giãn của tế bào và hình thành rễ. Sự cân bằng tỷ lệ giữa auxin và xytokynin có ý nghĩa quyết định trong quá trình phát sinh hình thái, sinh trưởng và phát triển chồi của mô nuôi cấy in vitro [13].
Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của sự phối hợp BA và α-NAA đến khả năng tái sinh chồi của các mẫu cấy là đoạn thân mang mắt ngủ của hai giống hoa chuông, sau 8 tuần theo dõi được trình bày ở bảng 3.2.
Số liệu bảng 3.2 cho thấy, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quyết định đến sự phát sinh chồi của các mô nuôi cấy. Trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thì các mẫu cấy không có sự kích ứng tạo chồi. Trong tổ hợp với α-NAA, khi tăng nồng độ BA từ 0,5-1mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi tăng, chất lượng chồi tốt. Tỷ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu cao nhất đạt được lần lượt là: 46,67% và 1,17 chồi/mẫu (hoa đỏ); 60% và 1,53 chồi/mẫu (hoa trắng), trên môi trường bổ sung 1mg BA/l kết hợp với 0,02mg α-NAA/l. Chồi to khoẻ, đồng đều, màu xanh đậm.
Kết quả nghiên cứu này, tạo được các chồi in vitro ở nồng độ BA và α-NAA thấp
hơn so với nghiên cứu của Jie (2004) [58], Naz và cs (2001) [83] và Ioja-Boldura và Ciulca (2013) [57]. Khi tăng nồng độ BA lên 1,5mg/l thì tỷ lệ mẫu tạo chồi và số chồi TB/mẫu đã giảm rõ rệt ở tất cả các mức nồng độ α-NAA.
Môi trường thích hợp để tái sinh chồi trong nhân giống in vitro cây hoa chuông là: MS + 1mg BA/l + 0,02mg α-NAA/l + 6,5g agar/l + 30g saccarose/l. Kết quả này góp phần làm giảm chi phí đầu vào (chất kích thích sinh trưởng BA và α- NAA) trong quy trình nhân giống in vitro cây hoa chuông.
Từ kết quả thu được, chúng tôi phân tích hồi quy, xác định được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ BA và α-NAA đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi. Tuy nhiên, kết quả phân tích ANOVA ở mức xác suất P = 0,05 thì tỷ lệ mẫu tái sinh chồi thu được không phụ thuộc vào nồng độ α-NAA (Px21 = 0,8247 > 0,05 (hoa đỏ); Px22 = 0,3244 > 0,05 (hoa trắng); với x21: nồng độ α-NAA cho giống hoa đỏ; x22: nồng độ α-NAA cho giống hoa trắng) (Phụ lục 4) mà chỉ phụ thuộc vào nồng độ BA bổ sung. Đồng thời, mối tương quan giữa tỷ lệ mẫu tái sinh chồi và nồng độ BA là tương đối chặt (r = 0,612 - 0,619). Vì vậy, mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ BA và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi như sau:
y1 = - 16,667x12 + 40x1 - 3,75 (r1 = 0,612) y2 = - 19,1667x22 + 48x2 - 4,7083 (r2 = 0,619)
Trong đó: x là nồng độ BA; y: tỷ lệ mẫu tái sinh chồi; r: là hệ số tương quan (y1, x1, r1: giống hoa màu đỏ cánh kép; y2, x2, r2: giống hoa màu trắng cánh đơn).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng phối hợp của BA và -NAA đến khả năng tái sinh chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
(sau 8 tuần nuôi cấy) BA (mg) α-NAA (mg) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu (cái) Chất lượng chồi Hoa màu đỏ cánh kép 0,0 0,00 0,00f 0,00d - 0,5 0,00 0,00f 0,00d - 0,01 3,33ef 0,03d +++ 0,02 0,00f 0,00d - 0,03 0,00f 0,00d +++ 1,0 0,00 10,00e 0,17cd +++ 0,01 33,33b 0,77b +++ 0,02 46,67a 1,17a +++ 0,03 20,00d 0,23c +++ 1,5 0,00 6,67ef 0,13cd ++ 0,01 23,33cd 0,30c ++ 0,02 30,00bc 0,60b + 0,03 0,00f 0,00d - LSD0,05 6,84 0,17 -
Hoa màu trắng cánh đơn
0,0 0,00 0,00f 0,00e - 0,5 0,00 0,00f 0,00e - 0,01 3,33ef 0,07de +++ 0,02 0,00f 0,00e - 0,03 0,00f 0,00e - 1,0 0 16,67d 0,20d +++ 0,01 43,33b 0,83b +++ 0,02 60,00a 1,53a +++ 0,03 36,67b 0,73b +++ 1,5 0 10,00de 0,10de +++ 0,01 26,67c 0,40c +++ 0,02 40,00b 0,80b ++ 0,03 6,67ef 0,07de + LSD0,05 9,36 0,18 -
Ghi chú: a, b, c, d, e, f, chỉ ra các công thức có cùng ký tự trong một cột không có sai khác ý nghĩa tại mức α = 0,05. +++ Chồi to, khỏe, lá màu xanh đặc trưng, ++ Chồi nhỏ, lá bé màu xanh nhạt, + Chồi nhỏ, lá bị cong-mọng nước.
Từ phương trình toán học và hệ số tương quan thu được cho thấy, cần xác định được nồng độ BA bổ sung phù hợp để thu được tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất, làm tăng nguồn vật liệu khởi đầu (chồi in vitro) trong nhân giống in vitro
cây hoa chuông.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tăng hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
Các chồi được tạo thành ở thí nghiệm trên được tách ra và cấy chuyển sang các môi trường nhân chồi để tạo ra số lượng chồi nhiều có chất lượng tốt, làm tăng hiệu quả của quy trình nhân giống in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ của BA đến khả năng tăng hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông màu đỏ cánh kép và màu trắng cánh đơn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Số liệu bảng 3.3 cho thấy, ở cả hai giống, trên môi trường không bổ sung BA, hệ số nhân chồi thu được thấp: 1,43 lần (hoa đỏ) và 1,57 lần (hoa trắng), chồi phát triển về chiều cao, số lá. Tuy nhiên, các chồi đều nhỏ, lá bé màu xanh nhạt.
Khi bổ sung BA nồng độ từ 0,1 - 1 mg/l, hệ số nhân chồi được cải thiện rõ rệt. Đối với giống hoa chuông màu đỏ cánh kép hệ số nhân chồi thu được đạt giá trị cao nhất là 5,10 lần ở môi trường bổ sung 0,5 mg BA/l, chồi phát triển tốt, thân mập, khỏe, lá màu xanh đậm. Ở giống hoa chuông màu trắng, hệ số nhân tăng tỷ lệ thuận với nồng độ BA bổ sung (0,1 - 0,7 mg BA/l). Hệ số nhân thu được ở giống hoa màu trắng cao hơn hẳn giống hoa màu đỏ và đạt cao nhất là 8,57 lần ở môi trường bổ sung 0,7 mg BA/l. Tuy nhiên, các chồi thu được có chất lượng giảm (chồi nhỏ, lá bé màu xanh nhạt, một số lá bị biến dạng). Tăng nồng độ BA lên 1 mg/l thì hệ số nhân bắt đầu giảm ở cả hai giống, một số chồi bắt đầu có những biểu hiện thay đổi về hình thái bên ngoài như: chồi nhỏ, lá bị cong mọng nước, xuất hiện các khối callus màu xanh nhạt.
Như vậy, BA là hợp chất cytokinine có tác dụng tốt tới khả năng nhân nhanh chồi trong nhân giống in vitro cây hoa chuông. Nồng độ BA bổ sung vào môi trường nhân nhanh chồi in vitro phù hợp nhất là 0,5 mg BA/l.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tăng hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồiin vitro ở hai giống hoa chuông
(sau 6 tuần nuôi cấy) BA
(mg)
Hệ số nhân chồi (lần)
Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (cái) Chất lượng chồi Hoa màu đỏ cánh kép 0,0 1,43e 4,37a 5,90a ++ 0,1 2,60d 3,22b 4,80b ++ 0,3 3,83c 2,73c 4,40c +++ 0,5 5,10a 2,30d 3,90d +++ 0,7 5,17a 2,21d 3,70e ++ 1,0 4,90b 1,91e 3,40f ++ LSD0,05 0,20 0,14 0,19 -
Hoa màu trắng cánh đơn
0,0 1,57e 4,25a 6,00a ++ 0,1 4,00d 3,13b 5,07b +++ 0,3 6,87c 2,85c 4,67c +++ 0,5 7,83b 2,34d 4,03d +++ 0,7 8,57a 2,28d 3,90de ++ 1,0 7,20c 1,89e 3,67e + LSD0,05 0,45 0,23 0,33 -
Ghi chú: a, b, c, d, e, f, chỉ ra các công thức có cùng ký tự trong một cột không có sai khác ý nghĩa tại mức α = 0,05, +++ Chồi to, khỏe, lá màu xanh đậm, ++ Chồi nhỏ, lá bé màu xanh nhạt, + Chồi nhỏ, lá bị cong, mọng nước, xuất hiện các khối callus màu xanh nhạt
Từ kết quả thu được, chúng tôi phân tích hồi quy, xác định được mô hình toán học và đồ thị (Phụ lục 4) biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ BA và hệ số nhân chồi như sau:
y1 = -6,9118x12 + 10,268x1 + 1,509 (r1 = 0,993) y2 = -14,682x22 + 19,93x2 + 1,8717 (r2 = 0,989)
Trong đó: x là nồng độ BA; y: là hệ số nhân chồi; r: là hệ số tương quan (y1, x1, r1: giống hoa màu đỏ cánh kép; y2, x2, r2: giống hoa màu trắng cánh đơn).
Từ mô hình toán học và hệ số tương quan thu được cho thấy, hệ số nhân chồi có tương quan rất chặt với nồng BA bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy (r = 0,993 - 0,989). Vì vậy, cần xác định được nồng độ BA bổ sung phù hợp để thu được hệ số nhân chồi cao nhất, đồng thời các chồi in vitro tạo ra có chất lượng tốt.