5. Những đóng góp mới của luận án
2.3.1. Nội dung 1
hoa chuông)
* Các công thức thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng và cơ quan nuôi cấy đến sự tạo nguồn vật liệu khởi đầu ở hai giống hoa chuông
Mục đích: Xác định được thời gian và cơ quan đưa vào nuôi cấy có hiệu quả nhất để tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong nhân giống in vitro cây hoa chuông.
Thí nghiệm gồm 12 công thức, tương ứng với 4 mốc thời gian và 3 cơ quan khác nhau. Hóa chất khử trùng sử dụng là HgCl2 0,1% (thí nghiệm 2 yếu tố được tiến hành độc lập trên 2 giống). Các công thức trong thí nghiệm này được trình bày trong bảng 2.1
Hoa màu đỏ cánh kép và màu trắng cánh đơn
Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây
hoa chuông (Nghiên cứu phương pháp khử trùng, nghiên cứu tái
sinh và nhân nhanh chồi, nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh)
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của cây cấy mô ở giai đoạn vườn ươm (Nghiên cứu khối lượng cây in vitro, thời vụ, giá thể, phân bón)
Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật trồng cây hoa thương phẩm (Nghiên cứu thời vụ, phân bón, biện pháp bấm ngọn)
Thực nghiệm trồng cây hoa chuông thương phẩm
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm trong nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng và cơ quan nuôi cấy đến sự tạo nguồn vật liệu khởi đầu ở hai giống hoa chuông
Công thức Thời gian (phút) Cơ quan
Công thức I
5
Đoạn thân
Công thức II Lá non
Công thức III Nụ non
Công thức IV 7 Đoạn thân Công thức V Lá non Công thức VI Nụ non Công thức VII 10 Đoạn thân
Công thức VIII Lá non
Công thức IX Nụ non
Công thức X
15
Đoạn thân
Công thức XI Lá non
Công thức XII Nụ non
Môi trường nền được sử dụng cho các công thức thí nghiệm là: MS + 30% Saccarose/l + 6%Agar/l.
Đánh giá thí nghiệm sau 02 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BA và -NAA đến khả năng tái sinh chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
Mục đích: Xác định được tổ hợp BA và -NAA ở nồng độ phù hợp, có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng tái sinh chồi in vitro.
Nguồn mẫu là đoạn thân mang mắt ngủ (kế thừa kết quả của thí nghiệm 1)
Thí nghiệm gồm 13 công thức, tương ứng với 13 tổ hợp BA và -NAA ở các
mức nồng độ khác nhau (thí nghiệm 2 yếu tố được tiến hành độc lập trên 2 giống). Các công thức trong thí nghiệm này được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm trong nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BA và -NAA đến khả năng tái sinh chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
Công thức BA (mg) α-NAA (mg) Công thức I (Đ/c) 0,0 0,00 Công thức II 0,5 0,00 Công thức III 0,01 Công thức IV 0,02 Công thức V 0,03 Công thức VI 1,0 0,00 Công thức VII 0,01 Công thức VIII 0,02 Công thức IX 0,03 Công thức X 1,5 0,00 Công thức XI 0,01 Công thức XII 0,02 Công thức XIII 0,03
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tăng hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
Mục đích: Xác định được nồng độ BA có ảnh hưởng tốt nhất đến hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi.
Nguồn mẫu là các chồi in vitro được tạo ra từ thí nghiệm 2, cắt chồi thành từng đoạn mang mắt ngủ, cấy vào các công thức thí nghiệm.
Thí nghiệm gồm 6 công thức, tương ứng với 6 mức nồng độ BA khác nhau (thí nghiệm 1 yếu tố được tiến hành độc lập trên 2 giống).
- Công thức I: MS + 0,0 mg BA/l + 30% Saccarose/l + 6% Agar/l (Đ/C).
- Công thức II: Đ/C + 0,1 mg BA/l.
- Công thức III: Đ/C + 0,3 mg BA/l.
- Công thức IV: Đ/C + 0,5 mg BA/l.
- Công thức V: Đ/C + 0,7 mg BA/l.
- Công thức VI: Đ/C + 1,0 mg BA/l.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ -NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
Mục đích: Xác định được nồng độ -NAA có ảnh hưởng tốt nhất đến sự ra rễ
của chồi in vitro.
Nguồn mẫu là các cụm chồi in vitro được tạo ra từ thí nghiệm 3 có kích thước 3 - 3,5 cm, tách riêng từng chồi, cấy vào các công thức thí nghiệm.
Thí nghiệm gồm 5 công thức, tương ứng với 5 mức nồng độ -NAA khác nhau (thí nghiệm 1 yếu tố được tiến hành độc lập trên 2 giống).
- Công thức I: MS + 0,0 mg -NAA/l + 30% Saccarose/l + 6% Agar/l (Đ/C).
- Công thức II: Đ/C + 0,1 mg -NAA/l. - Công thức III: Đ/C + 0,2 mg -NAA/l.
- Công thức IV: Đ/C + 0,3 mg -NAA/l.
- Công thức V: Đ/C + 0,5 mg -NAA/l.
Đánh giá thí nghiệm sau 04 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần.
* Phương pháp lấy mẫu đưa vào nuôi cấy
Mẫu đưa vào nuôi cấy: Đoạn thân mang mắt ngủ, lá non, nụ non của hai giống hoa chuông màu đỏ cánh kép và màu trắng cánh đơn
- Đoạn thân mang mắt ngủ: Chọn những cây khỏe đang trong thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng, có kích từ 4 - 5 cm, cắt bỏ lá, rửa dưới vòi nước chảy, rửa bằng xà phòng, rửa lại bằng nước cất vô trùng, xử lý hoa chất khử trùng. Cắt từng đoạn có chứa mắt ngủ, kích thước từ 1 - 1,5 cm, cấy vào môi trường nền.
- Lá non: Chọn những lá non của những cây khỏe, đang trong thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng, rửa dưới vòi nước chảy, rửa bằng xà phòng, rửa bằng nước cất vô trùng, xử lý hóa chất khử trùng. Cắt thành từng mảnh có kích thước khoảng 1 x 1 cm, cấy vào môi trường nền.
- Nụ non: Chọn nụ của cây khỏe, có kích thước từ 2 - 3 cm, rửa dưới vòi nước
chảy, rửa bằng xà phòng, rửa bằng nước cất vô trùng, xử lý hóa chất khử trùng. Dùng dao mũi nhỏ tách bỏ lớp lá đài và cánh hoa non, lấy toàn bộ phần đài nụ cắt thành từng mảnh có kích thước từ 3 - 5mm, cấy vào môi trường nền.
* Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 mẫu, theo dõi 30 mẫu.
* Điều kiện thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy cơ bản: Sử dụng môi trường dinh dưỡng khoáng Murashige và Skoog (1962) [81], ký hiệu MS (Phụ lục 2).
pH môi trường: 5,8.
Khử trùng môi trường nuôi cấy bằng phương pháp khử trùng ướt ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
Mẫu được nuôi ở điều kiện nhân tạo: nhiệt độ 25oC ± 2oC, nguồn chiếu sáng đèn huỳnh quang, cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux.
* Các kỹ thuật áp dụng
Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật thường quy.
* Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ tháng 8/2012 đến tháng 3/2013.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào, Bộ môn Di truyền - Giống, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Huế.
2.3.2. Nội dung 2 (Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật ươm cây giống hoa chuông in vitro giai đoạn vườn ươm)