5. Những đóng góp mới của luận án
1.2.3. Nhân giống vô tính invitro cây hoa chuông
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống, thường được sử dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bằng việc sử dụng các bộ phận khác nhau của cây với kích thước nhỏ.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng, dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật.
1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberland lần đầu tiên đã quan niệm rằng: mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều mang toàn bộ thông tin di truyền (ADN) của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [117].
Như vậy, từ một tế bào (mô) bất kỳ trên cây (Hình 1.3) có thể điều khiển để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh, khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hóa, phản phân hoá.
Hình 1.3. Các loại mô trên cây được sử dụng nuôi cấy
1.2.3.2. Phân hoá và phản phân hoá tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào.
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể.
Quá trình phân hoá của tế bào:
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hoá chức năng Tuy nhiên, sau khi tế bào phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Đó là quá trình phản phân hoá tế bào.
Tế bào chuyên hoá (mô) Tế bào phôi sinh [85], [91].
Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro đã mở ra một hướng phát triển mới trong ngành nông nghiệp, giúp tăng sản lượng và chất lượng cây giống, đảm bảo nguồn cung cấp cây giống có chất lượng tốt cho thực tiễn sản xuất.
1.2.3.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro
Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng
cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige của trường Ðại học California đã chia quy trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn [82] và một giai đoạn tiếp sau in vitro:
1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro
Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã được khử trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới. Giảm tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này. Theo Yildiz (2012) [131], mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng thành. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần.
2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro
Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất. Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin).
3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con
Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ.
Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định.
4. Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên [51], [53]. Sự biến động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên.
Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in vitro vào thực tiễn. Tuy nhiên, đối với cây hoa chuông do toàn thân được phủ một lớp lông tơ dày, thân lá chứa nhiều nước nên giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu gặp nhiều khó khăn (số lượng mẫu nhiễm và chết rất cao). Vì vậy, để tăng hiệu quả của giai đoạn này cần lựa chọn được hóa chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan sinh dưỡng đưa vào nuôi cấy.
1.2.3.4. Đặc điểm của cây giống in vitro
Cây giống in vitro khi đưa ra môi trường tự nhiên, gặp một số vấn đề như sau: -Cây dễ bị mất nước do cấu trúc lá có lớp cutin trên bề mặt ít.
-Bộ máy quang hợp và lục lạp kém phát triển.
-Rễ của các chồi không có khả năng đồng hóa cabon và thường bị chết do
rễ được hình thành từ callus thân, cho nên mối liên kết rễ - không bào và thân không tốt.
Vì vậy, trước khi đưa cây ra ngoài cần phải có các biện pháp xử lý để tăng khả năng sống sót của cây. Các biện pháp đó gọi là tôi luyện cây trước khi đưa cây ra ngoài.
Việc tôi luyện cây bao gồm:
- Giảm thể nước của môi trường.
- Giảm ẩm độ trong bình nuôi cây.
Cả 2 dạng xử lý nhằm phát triển chức năng của khí khổng và lớp cutin. Các biện pháp có thể áp dụng như: đậy nút bình bằng các vật liệu có thể thoát hơi nước, mở nắp bình trước khi trồng vài ngày, khi cho cây ra rễ in vitro điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ cao hơn các giai đoạn trước… [85], [91].
Cây in vitro đã tôi luyện, khi chuyển ra vườn ươm có thể gặp các trở ngại khác như nhiệt độ, ấm độ, dinh dưỡng bổ sung... Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu miền Trung Việt Nam, có mùa hè khô nóng và mùa đông lạnh ẩm, thì các nghiên cứu cụ thể cần được thực hiện (thời vụ ươm, giá thể ươm, dinh dưỡng thích hợp,…), để làm cơ sở khoa học khi đưa cây giống in vitro ra vườn ươm, nhằm giảm tỷ lệ chết,
cây thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên, tăng khả sinh trưởng. Đây là cơ sở lý luận và thực tiễn để xây dựng quy trình kỹ thuật ươm cây giống hoa chuông in vitro ở giai đoạn vườn ươm trong điều kiện cụ thể của mỗi vùng.
1.2.3.5. Những yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro a. Sự lựa chọn mẫu cấy
Theo Mantell và cs (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng [77].
Mô non như đỉnh chồi nách, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây. Thời vụ và giai đoạn sinh trưởng của cây mẹ có ảnh hưởng hoàn toàn khác nhau tới khả năng tái sinh, phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [50].
b. Phương pháp vô trùng mẫu
Mẫu vật trước khi đưa vào nuôi cấy, được xử lý vô trùng bằng các loại hóa chất hoặc những tác động khác. Hoạt tính của hoocmon nội sinh ở mẫu vật nuôi cấy, khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào, khả năng tái sinh,… của mẫu cấy sẽ bị ảnh hưởng rõ rệt do các phương pháp xử lý vô trùng [32]. Vì vậy, đối với cây hoa chuông, để lựa chọn được phương pháp vô trùng mẫu phù hợp sẽ tạo tiền đề thuận lợi cho các giai đoạn tiếp theo của quy trình nhân giống in vitro.
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian xử lý nấm khuẩn bề mặt mẫu
Tác nhân vô trùng Nồng độ (%)
Thời gian xử lý (phút)
Hiệu quả
Calcium hypochlorid (Ca(OCl)2) 9-10 5 - 30 Rất tốt
Sodium hypochlorid (NaOCl) 2 5 - 30 Rất tốt
Bạc Nitrat (AgNO3) 1 5 - 30 Tốt
Oxy già (H2O2) 10-12 5 - 15 Tốt
Nước Brôm (Br2) 1-2 2 - 10 Rất tốt
Thủy ngân clorua (HgCl2) 0,1-1 2 - 10 Đạt yêu cầu
c. Môi trường nuôi cấy
Các nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy mô như nhiệt độ, ánh sáng, chất dinh dưỡng… trong đó dinh dưỡng khoáng giữ một vai trò quan trọng [80], [88]. Thành phần hoá học của môi trường có vai trò quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi cơ quan hay mục đích nuôi cấy khác nhau, có yêu cầu khác nhau về thành phần môi trường sử dụng [48], [128].
Hầu hết các loại môi trường cho nuôi cấy mô tế bào được các nhà nghiên cứu sử dụng (50 - 70%) [26] là môi trường MS (Murashige and Skoog) [81]. Thành phần chính của môi trường nuôi cấy mô tế bào bao gồm những nhóm chất chính sau đây:
* Các loại muối khoáng
- Các nguyên tố đa lượng
Có vai trò cấu trúc và chức năng, được sử dung trong môi trường nuôi cấy với nồng độ trên 30 ppm. Gồm các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca [118].
- Các nguyên tố vi lượng
Có vai trò hoạt hóa các enzim, được sử dụng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp hơn 30 ppm. Gồm các nguyên tố: Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, Ni [81], [118].
* Nguồn carbon hữu cơ
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, cũng có thể sống bán dị dưỡng nhờ vào khả năng quang hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, nhưng rất yếu nên không đủ nguồn carbon hữu cơ cho sự sinh trưởng phát triển của cây [122]. Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần được bổ sung nguồn carbon hữu cơ và thường dùng saccaroza, tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ có thể thay đổi từ 2 - 8% [67].
* Vitamin
Mô và tế bào nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp được các loại vitamin cần thiết, nhưng thường không đủ về lượng. Do đó, phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng độ khoảng 1 ppm [89], [126]. Bao gồm: vitamin B1, B2, B6…
Myoinositol có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc đẩy sự hình thành thành tế bào (sinh tổng hợp polygalacturonic axit và pectin). Thường sử dụng ở nồng độ cao 50 - 100 ppm.
* Nhóm chất tự nhiên
- Nước dừa: theo kết quả phân tích thành phần nước dừa [75], [76], [95], [119] cho thấy trong nước dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào như: các axit amin, axit béo, axit hữu cơ, đường, ARN, ADN, myoinositol, các chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin.
- Dịch chiết: dịch chiết nấm men, dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha), dịch chiết một số loại rau, quả tươi: khoai tây, chuối, cà rốt... [54].
* Chất làm đông môi trường
Các chất làm đông môi trường được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô là agar, agarose và gellan gum [96]. Agar là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu tảo hồng- Rodophyta) được chiết suất từ rong biển từ những năm 1650 đến 1660 bởi
một người nhật tên là Minoya Tarozaemon. Agar khi ngâm nước ở 80oC sẽ chuyển
sang dạng sol và 40oC thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao (6 - 12 g/lít nước) [94]. Ở trạng thái gel nhưng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng. Vì vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây trong nuôi cấy mô.
* Các chất điều hòa sinh trưởng
Trong tự nhiên, cây có khả năng tự tạo ra các chất phytohoocmon, nhưng trong nuôi cấy in vitro, các mô quá bé nên cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy để định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy [118]. Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng ở nồng độ thấp (0,001 - 10 µM) nhưng có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả nuôi cấy. Dựa vào hoạt tính sinh học và hướng tác dụng, các chất này được chia làm 5 nhóm.
- Các hợp chất auxin có vai trò kéo dài tế bào, tạo ưu thế đỉnh, hình thành rễ bất định,… gồm các chất như IAA (indolylacetic acid), α-NAA (α-naphthylacetic acid), 2,4-D (diclorophenoxy acetic acid), IBA (indolyl butyric acid)… Thông
thường, khi nồng độ auxin thấp sẽ kích thích sự tạo rễ, nồng độ auxin cao thì dẫn đến sự hình thành callus [110].
- Các hợp chất cytokinin quyết định sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự hình thành và phát triển chồi,… gồm các chất như kinetin, BAP (5- benzyl amino purin) và zeatin… Ở nồng độ cao (1 - 10 mg/l), cytokinin kích thích sự hình thành chồi bất định nhưng ức chế sự tạo rễ. Các chất này được tổng hợp ở rễ và được vận chuyển một cách thụ động lên phía trên.
- Các hợp chất gibberellin quyết định sự sinh trưởng của cây.
Quan trọng nhất trong nhóm này là gibberellin acid (GA3): có tác dụng kéo dài lóng đốt, kích thích sự sinh trưởng của các mô phân sinh, chồi...
- Axit absisic chất ức chế sinh trưởng. - Ethylen ức chế sinh trưởng gây sự già hoá.
Trong đó axit absisic và ethylen rất ít được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào [3].
d. Điều kiện nuôi cấy
Trạng thái môi trường, pH, nhiệt độ, ánh sáng, là những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan và hình thái của mô, tế bào thực vật.
Trạng thái môi trường:
Môi trường đặc: Được bổ sung 8 - 10% agar. Agar có độ ngậm nước cao, khả năng di đông tốt, nhiệt đô nóng chảy là 80oC, nhiệt độ đông đặc là 40oC.
Môi trường lỏng: Sử dụng cho các mục đích nuôi cấy khác nhau, môi trường nhân nhanh, nuôi cấy protoplast, dung dịch nuôi cấy huyền phù...
pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 - 6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng. Khi pH < 4 hoặc pH >7 thì sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây.
Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Các yếu tố ảnh hưởng như: cường độ chiếu sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng.
Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng phù hợp nằm trong khoảng 2000 - 2500 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng, có khả năng quang hợp. Kết quả nghiên cứu của Vince-Pure (1994) [121], Teresa và cs (2007) [116], đã chỉ ra nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và chất lượng cây giống.
Để mô cấy phát triển tốt thì phòng nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25 - 280C [17].