NGUYỄN THỊ HOÀI xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO đặc hòe GIÁC KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOÀI Mã sinh viên: 1601289 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC HỊE GIÁC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hồn thành khóa luận, em nhận giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu bạn bè gia đình Trước hết, em xin cảm Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội ln tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ bảo cho em suốt năm năm học qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Hồng Cường, người tận tình hướng dẫn, ln quan tâm, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình học tập thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn DS Vũ Thị Hiền – học viên cao học khóa 24, Trường Đại học Dược Hà Nội, chia sẻ, giúp đỡ hướng dẫn em tận tình thời gian em thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển thầy cô môn Dược học cổ truyền tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình làm thực nghiệm Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, người thân bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ em suốt q trình học tập Hà Nội, ngày 07 tháng 06 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Hoài MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vị thuốc Hòe giác 1.1.1 Vị trí phân loại đặc điểm thực vật Hòe 1.1.2 Bộ phận dùng 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng công dụng theo y học cổ truyền 1.1.5 Tác dụng sinh học Hòe giác sophoricosid 1.2 Tổng quan phương pháp hóa lý sử dụng đề tài nghiên cứu 1.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.3 Định tính, định lượng dược liệu Hịe giác 10 1.3.1 Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông 10 1.3.2 Dược điển Trung Quốc 2015 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Thiết bị, máy móc 15 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn, dược liệu chuẩn 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hịe giác TLC 16 2.3.2 Xây dựng phương pháp định tính định lượng cao đặc Hòe giác HPLC 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22 3.1 Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hịe giác TLC 22 3.1.1 Chuẩn bị mẫu 22 3.1.2 Điều kiện sắc ký 22 3.1.3 Kết định tính cao đặc Hịe giác TLC 23 3.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hịe giác HPLC 25 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 25 3.2.2 Vân tay sắc ký lỏng hiệu cao 26 3.2.3 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hịe giác HPLC 29 3.2.4 Định tính định lượng cao đặc Hòe giác HPLC 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN 39 4.1 Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hịe giác TLC 39 4.2 Xây dựng phương pháp định tính định lượng cao đặc Hịe giác HPLC 39 4.3 Định tính định lượng sophoricosid số mẫu cao đặc Hòe giác 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril C-HG Cao đặc Hòe giác DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam DL Dược liệu DL-C Dược liệu Hòe giác chuẩn DL-HG Dược liệu Hòe giác nguyên liệu ĐL Định lượng ĐT Định tính EtOH Ethanol HG Hịe giác HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao MeOH Methanol ODS Octadecylsilane bonded silica gel RRT Thời gian lưu tương đối RT Thời gian lưu SKĐ Sắc ký đồ SOP Sophoricosid TLC Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các isoflavonoid phân lập từ Hòe Bảng 1.2 Các flavonoid phân lập từ Hòe .5 Bảng 1.3 Giá trị RRT khoảng chấp nhận pic đặc trưng 12 Bảng 1.4 Chương trình dung mơi pha động 13 dsas Bảng 3.1 Kết sắc ký lớp mỏng định tính cao đặc Hịe giác bước sóng 254 nm 24 Bảng 3.2 Kết khảo sát dung môi chiết cao 25 Bảng 3.3 Thời gian lưu (RT) thời gian lưu tương đối (RRT) pic SKĐ 28 Bảng 3.4 Giá trị RRT pic đặc trưng 29 Bảng 3.5 Tính thích hợp hệ thống 30 Bảng 3.6 Cách pha, nồng độ kết mẫu chuẩn A-F 33 Bảng 3.7 Kết độ lặp lại độ xác trung gian 35 Bảng 3.8 Kết tiêu độ 36 Bảng 3.9 Thời gian lưu (phút) pic đặc trưng SKĐ 37 Bảng 3.10 Thời gian lưu tương đối (RRT) pic SKĐ 37 Bảng 3.11 Kết định lượng mẫu cao đặc Hòe giác 38 Bảng 3.12 Một số điểm phương pháp ĐT, ĐL cao đặc Hòe giác HPLC 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sophoricosid (SOP) Hình 1.2 Vân tay sắc ký đối chiếu Hòe giác 12 Hình 3.1 Sắc ký đồ định tính cao đặc Hịe giác bước sóng 254 nm 24 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn SOP 26 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu dược liệu Hòe giác chuẩn 26 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu dược liệu Hòe giác nguyên liệu 27 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu cao đặc Hòe giác 27 Hình 3.6 Vân tay sắc ký lỏng hiệu cao 29 Hình 3.7 Sắc ký đồ thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký 30 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu cao đặc Hòe giác 31 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn SOP 31 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu 32 Hình 3.11 Phổ hấp thụ UV mẫu thử mẫu chuẩn SOP 32 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Hịe giác chín Hịe (Sophora japonica L.), thu hái vào mùa đông, loại bỏ tạp phơi khơ Vị thuốc Hịe giác sử dụng y học cổ truyền với công nhiệt giảng hỏa, lương huyết huyết, chủ trị nhiệt đường ruột gây đại tiện huyết, trĩ xuất huyết, can nhiệt gây đau đầu, chóng mặt, mắt đỏ [13] Các nghiên cứu khoa học tác dụng Hòe giác sophoricosid – thành phần hoạt chất Hịe giác, bao gồm tác dụng chống viêm, dị ứng [20], [24], tăng tạo xương, giảm xương, cải thiện triệu chứng loãng xương phụ nữ mãn kinh [32], [27] tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan [28] Phương pháp sắc phương pháp dân gian áp dụng từ lâu để sử dụng nhiều vị dược liệu, có Hịe giác, nhiên phương pháp tốn thời gian nhiều gây bất tiện sử dụng Cao đặc bào chế từ vị thuốc Hịe giác bán thành phẩm sử dụng để tiếp tục bào chế thành thành phẩm viên nén, viên nang, cốm, tiện dùng Tuy nhiên, chưa có tài liệu quy định tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Hịe giác Vì vậy, việc khảo sát số tiêu chất lượng cao có ý nghĩa quan trọng cơng tác kiểm tra chất lượng, làm tiền đề để xây dựng tiêu chuẩn cao đặc Hòe giác chế phẩm Từ lý trên, đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hịe giác” nghiên cứu với mục tiêu sau: Khảo sát xây dựng phương pháp định tính cao đặc Hòe giác phương pháp sắc ký lớp mỏng Khảo sát xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hòe giác phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vị thuốc Hịe giác 1.1.1 Vị trí phân loại đặc điểm thực vật Hịe Vị trí phân loại: Cây Hịe có tên khoa học Styphnolobium japonicum (L.) Schott Sophora japonica (L.) Cây Hòe phân loại thực vật học sau [2], [33]: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Phân họ Đậu (Faboideae = Papilionoideae) Chi Sophora Loài Sophora japonica L Đặc điểm thực vật: Cây gỗ, to, cao đến 15 m, thân thẳng có chỏm trịn, vỏ nứt nẻ, màu nâu sẫm Cành nằm ngang, hình trụ, nhẵn, cong queo, màu lục nhạt có chấm trắng Lá kép lơng chim lẻ, mọc so le, có – 13 chét mọc đối, hình trứng, đỉnh nhọn, gốc tròn, nguyên, dài cm rộng 1,5 – 2,5 cm, màu lục nhạt, mặt dưới, có lơng, có kèm Cụm hoa hình chùy đầu cành, dài 20 cm, phân nhánh nhiều Hoa lưỡng tính, khơng đều, nhỏ, màu trắng vàng nhạt Đài hình chng, gần nhẵn Tràng hoa hình bướm màu trắng ngà Quả loại đậu, khơng mở, hình tràng hạt, nhẵn, dày thắt nhỏ lại không hạt Hạt – 5, hình bầu dục, dẹt, màu đen bóng [2], [3], [6], [7], [16] Ở nước ta, Hòe trồng số tỉnh miền bắc, nhiều Thái Bình Ở nước khác Trung Quốc, Triều Tiên, Hàn Quốc, Nhật Bản có trồng Ở số nước châu Âu, Hòe trồng làm cảnh [3], [16] Cây Hòe hoa vào khoảng tháng đến tháng 8, chín từ tháng đến tháng 11 [6] 1.1.2 Bộ phận dùng Trong y học cổ truyền, nhiều phận Hòe sử dụng làm thuốc Dược liệu nụ hoa gọi ‘Hòe mễ’, hoa nở gọi ‘Hịe hoa’ Hịe chín gọi ‘Hịe giác’ [3] Ngồi ra, rễ, cành non, vỏ Hòe sử dụng làm thuốc với số công dụng định [16] Hịe giác (Fructus Sophorae) chín Sophora japonica L (Fam Leguminosae), thu hái vào mùa đơng, loại bỏ tạp chất phơi khơ [13] Hịe giác có chiều dài – cm, đường kính – 10 mm, bên màu vàng lục đến nâu vàng, nhăn nheo thơ ráp Mặt bên có đường khớp màu vàng Kết cấu mềm, nhăn sau khơ, dễ bẻ gãy chỗ thắt Hạt hình trứng, dài – 11 mm, bề mặt nhẵn, màu đen đến nâu đen, rốn hạt tròn mặt lõm, màu trắng xám Hạt có kết cấu cứng, hai mầm màu vàng đến lục Vỏ mỏng, có vị đắng Hạt có vị giống đậu nhai [13], [14] 1.1.3 Thành phần hóa học Hiện nay, nghiên cứu hóa học S japonica phân lập xác định 70 hợp chất có Hịe Thành phần isoflavonoid flavonoid [16] a Isoflavonoid Isoflavonoid thành phần Hịe giác với gần 30 hợp chất phân lập [16], thành phần có hàm lượng lớn dược liệu sophoricosid (Hình 1.1) [12] Một số isoflavonoid khác: sophorabiosid, genistein, genistin dẫn chất khác genistein, [16] liệt kê Bảng 1.1 Hình 1.1 Sophoricosid (SOP) Tên IUPAC: 5,7 – dihydroxy – – [4 – [(2S, 3R, 4S, 5S, 6R) – 3,4,5 – trihydroxy – – (hydroxymethyl)oxan – – yl] oxyphenyl]chromen – – on [43] Công thức phân tử: C21H20O10, trọng lượng phân tử: 432,4 g/mol [43] Sophoricosid (SOP) thành phần hoạt chất có Hịe giác, hàm lượng khoảng 10,2% [12] Với nhiều tác dụng dược lý bật chiếm hàm lượng lớn Hòe, sophoricosid ghi chép Dược điển Trung Quốc 2015 tiêu chuẩn để đánh giá kiểm tra chất lượng Hòe giác chế phẩm Hàm Phụ lục 2.2 Sắc ký đồ độ xác Phụ lục 2.3 Sắc ký đồ chuẩn Sophoricosid A Phụ lục 2.4 Sắc ký đồ dược liệu chuẩn Phụ lục 2.5 Sắc ký đồ dược liệu nguyên liệu Phụ lục 2.6 Sắc ký đồ mẫu cao Phụ lục 2.7 Sắc ký đồ mẫu cao Phụ lục 3.8 Sắc ký đồ mẫu cao Phụ lục 3.9 Sắc ký đồ mẫu cao Phụ lục 3.10 Sắc ký đồ mẫu cao PHỤ LỤC PHIẾU KIỂM NGHIỆM Phụ lục 3.1 Phiếu kiểm nghiểm dược liệu Hòe giác BẢN DỊCH 00 – A0-0—00—0—G-00 PHIẾU KIỂM NGHIỆM Số báo cáo: 121837 HOÈ GIÁC Số kiểm nghiệm 21010793 Tên sản phẩm Hoè giác Số lô 112008202 Ngày lấy mẫu 28/08/2020 Tiêu chuẩn CP 2015 Ngày báo cáo 04/09/2020 Phương pháp lấy Quy trình thao tác lấy mẫu dược liệu số 0211, CP mẫu 2015 Nội dung Hình thức Tiêu chuẩn Phù hợp với yêu cầu mục 0212, CP 2015 Kết Kết luận Phù hợp Đạt + Đạt Mục 0512 CP 2015: sắc ký lỏng: sắc ký đồ Định tính mẫu thử phải có vết vị trí so với vết sắc ký đồ chất chuẩn Mục 2331 CP2015: Không phát kiểm tra tàn dư SO2 Giới hạn kiểm ≤ 150 mg/kg tra: mg/kg SO2 Đạt Mục 0512 CP2015: Hàm lượng sắc ký lỏng 5.8% Đạt Sophoricoside ≥ 4.0% Kết luận: Người phê duyệt Xia Jun Feng Chế phẩm đạt tiêu chuẩn CP 2015 chất lượng Người kiểm tra: Zhu Cai Jiu Người soạn thảo: Yang Chun Mei Phụ lục 3.2 Phiếu kiểm nghiệm chất chuẩn sophoricosid Phụ lục 3.3 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Hòe giác chuẩn BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC HỊE GIÁC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2021 ... ? ?Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hòe giác? ?? nghiên cứu với mục tiêu sau: Khảo sát xây dựng phương pháp định tính cao đặc Hịe giác phương pháp sắc ký lớp mỏng Khảo sát xây dựng. .. tính cao đặc Hòe giác TLC 39 4.2 Xây dựng phương pháp định tính định lượng cao đặc Hòe giác HPLC 39 4.3 Định tính định lượng sophoricosid số mẫu cao đặc Hòe giác 43 KẾT LUẬN... Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hịe giác sắc ký lớp mỏng (TLC) Khảo sát điều kiện sắc ký Định tính cao đặc Hịe giác TLC 2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hòe giác sắc