NGUYỄN QUANG ĐOÀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) BẰNG HPLC.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ĐOÀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ĐOÀN Mã sinh viên: 1401142 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS.Ths.Nguyễn Lâm Hồng Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích & Độc chất HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin cảm NCS.Ths.Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên môn Hóa phân tích & độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập trường q trình thực khóa luận Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ động viên suốt trình học tập vừa qua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Sinh viên Nguyễn Quang Đoàn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT CỦA CHI CÁCH HOA 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceca) .2 1.1.3 Chi Cleistanthus .2 1.1.4 Loài Cleistanthus tonkinensis 1.1.5 Loài Cleistanthus indochinensis 1.2 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT CLEISINDOSID D 1.2.1 Sơ lược hợp chất cleisindosid D 1.2.2 Các nghiên cứu trước hợp chất cleisindosid D 1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 1.3.1 Khái niệm chiết xuất: 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết xuất 1.3.3 Các kĩ thuật chiết xuất .7 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 NGUYÊN LIỆU 10 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .10 2.1.2 Nguyên liệu chất chuẩn 10 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ .10 2.1.4 Dung môi, hóa chất 10 2.2 Phương pháp nghiên cứu .11 2.2.1 Phương pháp chiết xuất Cleisindosid D từ số loài chi cách hoa (Cleistanthus) 11 2.2.2 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Cleisindosid D .12 2.2.3 Xác định hàm lượng cleisindosid D số loài thuộc chi Cleistanthus 15 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu .15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D BẰNG HPLC 16 3.1.1 Xây dựng qui trình sắc ký định lượng cleisindosid D từ số loài thuộc chi Cleistanthus HPLC/DAD 16 3.1.2 Xây dựng qui trình chiết xuất cleisindosid D từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis) 19 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindosid D từ Chà chôi HPLC/DAD 22 3.2.1 Độ đặc hiệu: 22 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống sắc ký: .24 3.2.3 Khoảng tuyến tính 24 3.2.4 Độ lặp lại 26 3.2.5 Độ đúng: 27 3.3 SƠ BỘ ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CLEISTANTHUS 27 3.3.1 Điều kiện sắc ký 27 3.3.2 Tiến hành chiết xuất chạy sắc ký .28 3.3.3 Kết định lượng .28 3.4 BÀN LUẬN 29 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .31 4.1 KẾT LUẬN: 31 4.2 ĐỀ XUẤT .32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT APG Hệ thống phân loại thực vật GLP Thực hành tốt phòng thí nghiệm HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HT29 Tế bào ung thư Đại tràng IC50 Nồng độ ức chế 50% số lượng cá thể IUPAC Hiệp hội quốc tế hóa học ứng dụng KB Tế bào biểu mô LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MCF7 Tế bào ung thư vú MCF7R Tế bào ung thư vú kháng thuốc SK Sắc ký SKĐ Sắc ký đồ WHO Tổ chức Y Tế Thế giới DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tiêu Cleistanthus tonkinensis Hình 1.2 Quả Cleistanthus tonkinensis Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo cleisindosid D Hình 3.1 SKĐ khảo sát khả tách cleisindosid C với cleisindosid D cleisindosid D với 7,8-dihydrocleisindosid D dung dịch chuẩn phân giải 17 Hình 3.2 SKĐ khảo sát khả tách cleisindosid C cleisindosid D dược liệu cột RP18 Innersustain (250 x 4,6 mm; 5µm) hệ pha động ACNNước .17 Hình 3.3 Phổ UV cleisindosid D 18 Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu 18 Hình 3.5 Kết hàm lượng cleisindosid D Chà chôi chiết xuất hệ dung môi khác 20 Hình 3.6 Khảo sát kỹ thuật chiết .20 Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất cleisindosid D từ thuộc chi Cleistanthus 21 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chiết xuất bã dược liệu sau chiết .22 Hình 3.9 SKĐ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn 22 Hình 3.10 Hệ số tinh khiết Pic 23 Hình 3.11 Sắc ký mẫu thử phân huỷ điều kiện khắc nghiệt .23 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic cleisindosid D 25 Hình 3.13 Mẫu thử lồi Cleistanthus eberhardtii 29 Hình 3.14 Mẫu thử loài Cleistanthus tonkinensis .29 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Xây dựng chương trình Gradient 16 Bảng 3.2 Chương trình Gradient lựa chọn để chạy sắc ký .19 Bảng 3.3 Kết thu từ lần tiêm dung dịch chuẩn .24 Bảng 3.4 Kết khảo sát tính tuyến tính .25 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại cleisindosid D mẫu thử 26 Bảng 3.6.Kết đánh giá độ cleisindosid D mẫu thử C.tonkinesis 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới, ung thư nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai toàn cầu với 8,8 triệu người chết năm 2015 [31] Có nhiều hướng điều trị sử dụng như: hóa trị, xạ trị, can thiệp ngoại khoa,…tuy nhiên kết chưa mong đợi Điều thúc nhà khoa học luôn cố gắng tìm phương pháp loại thuốc mới, có nguồn gốc hóa dược dược liệu, để chống lại bệnh Tại Việt Nam, thuốc điều trị ung thư quan tâm phát triển, đặc biệt thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật hệ thực vật Việt Nam" khởi động, dịch chiết ethyl acetat 2500 loài thực vật Việt Nam đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thư dòng ung thư biểu mô Một kết bật dịch chiết từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư biểu mơ đạt từ 88,40 - 95,17% Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu phân lập, tinh chế xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, có hoạt chất cleisindosid D có cấu trúc hóa học tương tự etoposid teniposid, hai dẫn chất podophyllotoxin sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi Tuy nhiên nghiên cứu dừng lại mức phát píc chất Dựa kết này, nhóm tác giả định nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình chuẩn để xác định hàm lượng Cleisindosid D chiết xuất từ Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thư Chúng tiến hành đề tài:"Xây dựng phương pháp định lượng Cleisindosid D số loài thuộc chi cách hoa Cleistanthus HPLC" với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Cleisindosid D số loài thuộc chi Cách hoa (Cleistanthus) HPLC Ứng dụng phương pháp xây dựng sơ định lượng Cleisindosid D số loài thuộc chi Cách hoa (Cleistanthus) CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT CỦA CHI CÁCH HOA 1.1.1 Vị trí phân loại Theo APG [24], họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) phân loại sau: Thực vật có hoa (Angiosperms) Thực vật hai mầm thật (Eudicots) Nhánh Hoa hồng (Rosids) Bộ Sơ-ri (Malpighiales) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) 1.1.2 Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceca) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) hay gọi họ Đại Kích họ lớn thực vật có hoa với 240 chi khoảng 6000 loài Trước chia thành phân họ bao gồm Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae Phyllanthoideae Ba phân họ phân họ mầm hai phân họ sau hai mầm [34] Phần lớn thân thảo, khu vực nhiệt đới tồn loài bụi thân gỗ, phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới [5] 1.1.3 Chi Cleistanthus Cleistanthus (do chữ Latin cleisto, bắt nguồn từ chữ Hy Lạp kleistos: đóng, không mở anthos: hoa kết hợp thành) dịch sang Tiếng Việt cách hoa cọc rào Là gỗ nhỏ hay nhỡ, mọc so le xếp hai dãy, nguyên Cụm hoa nách lá, thành xim đơn bơng, nhiều hoa hoa; bắc thường ngắn hoa; hoa khơng cuống có cuống, gốc khác gốc; đài hợp gốc Hoa đực có 4-6 đài, thường 5, xếp van Cánh hoa nhỏ, thường nguyên Đĩa mật phẳng hay lồi Bầu khơng lơng có lơng nhung Quả nang có mảnh vỏ tròn lưng; hạt hình trứng - góc [9] Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 lồi mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến Australia Ở nước ta, theo sách "Cây cỏ Việt Nam" tác giả Phạm Hồng Hộ [6], chi Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp nước, từ Hà Giang tới Phú Quốc Nhận xét: - Khi khảo sát kĩ thuật chiết xuất thấy kĩ thuật chiết Soxhlet chiết đồng thời cleisindosid D hệ dung mơi MeOH-H2O (91) có hàm lượng cao Kết luận: Kĩ thuật chiết Soxhlet lựa chọn 3.1.2.3 Qui trình chiết xuất cleisindosid D Cân 1,0 g bột khô Thêm 50 mL MeOH-H2O (9-1) Chiết Soxhlet/2,5 Dịch chiết cách thuỷ đến cắn Hồ tan cắn ACNH2O (1-1) Bình đ.mức 50,0 mL Lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiêm sắc ký kí Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất cleisindosid D từ thuộc chi Cleistanthus Sau tiến hành chiết 1,0 g bột khô với 50 ml MeOH-H2O (9-1) kĩ thuật chiết Soxhlet 2,5 theo qui trình Bã dược liệu thêm 50 ml dung môi MeOH-H2O (9-1) tiến hành chiết Soxhlet tiếp 2,5 Dịch chiết thu đem cô cách thuỷ đến cắn, thêm xác ml dung mơi ACN-H2O (1-1), siêu âm 15 phút, tiến hành tiêm sắc ký để xác định hàm lượng cleisindosid D lại bã dược liệu 21 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chiết xuất bã dược liệu sau chiết Kết quả: Diện tích pic cleisindosid D dung dịch cắn: S7B = 17.838 Suy hàm lượng cleisindosid D dung dịch cắn: 0,010% Diện tích pic cleisindosid D dung dịch cắn: S7B = Suy hàm lượng cleisindosid D dung dịch cắn: 0,00% % Hàm lượng cleisindosid D cắn so với hàm lượng cleisindosid D chiết sau lần chiết với qui trình xây dựng 0,85% < % Như qui trình chiết 1,0 g bột khô Chà chôi với 50 ml MeOH-H20 (9-1) kĩ thuật chiết Soxhlet 2,5 chiết kiệt cleisindosid D dược liệu 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindosid D từ Chà chôi HPLC/DAD 3.2.1 Độ đặc hiệu: Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu trắng ACN-H2O (1-1), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn chuẩn bị mục 3.3.2.1, ghi lại sắc ký đồ thông số thời gian lưu, diện tích pic thu (Hình 3.9) Dung mơi pha mẫu ACN-H2O (1-1) (a) Dung dịch chuẩn hỗn hợp (b) Dung dịch thử (c) Dung dịch thử thêm chuẩn (d) Hình 3.9 SKĐ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn Nhận xét: 22 - Trên SKĐ mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn (Hình 3.9c 3.9d) xuất pic cleisindosid D thời gian lưu tương ứng 9,329 phút tương ứng với pic cleisindosid D có thời gian lưu 9,279 phút SKĐ dung dịch chuẩn (Hình 3.9b) - Hệ số tinh khiết píc cleisindosid D chuẩn 0,999986 (Hình 3.10a); Hệ số tinh khiết píc cleisindosid D thử 0,996603 (Hình 3.10c) hệ số tinh khiết píc cleisindosid D mẫu thử thêm chuẩnI (3.10b) 0,996311 Hình 3.10a Mẫu chuẩn Hình 3.10bMẫu thêm chuẩn Hình 3.10c Mẫu thử Hình 3.10 Hệ số tinh khiết Pic Tiến hành sắc ký mẫu thử phân huỷ điều kiện khắc nghiệt như: 100oC/2 giờ; H2O2 30%/4 giờ; UV 254 nm/24 Dung dịch thử Cách thuỷ 100oC/2 Phân huỷ H2O2 30% Soi đèn UV/24 Hình 3.11.Sắc ký mẫu thử phân huỷ điều kiện khắc nghiệt 23 Nhận xét: - Các dung dịch thử chiết từ dung môi MeOH-H2O (9-1) phân huỷ điều kiện khắc nghiệt đun cách thuỷ 100oC vòng giờ, phân huỷ H2O2 30% giờ, soi đèn UV/24 dung dịch ổn định không xuất thêm tạp chất phân huỷ 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống sắc ký: ❖ Chuẩn bị mẫu chuẩn cleisindosid D: - Mẫu chuẩn cleisindosid D gốc 1: Cân xác khoảng 5,31 mg cleisindosid D chuẩn vào bình định mức 10 ml, hồ tan định mức vừa đủ ACN-H2O (1-1) Lắc - Mẫu chuẩn làm việc cleisindosid D (1): Hút xác 1,00 mL dung dịch chuẩn cleisindosid D gốc cho vào bình định mức 10 mL, định mức vừa đủ ACN-H2O (1-1) - Tiêm lần mẫu chuẩn Bảng 3.3 Kết thu từ lần tiêm dung dịch chuẩn STT Cleisindosid D Thời gian lưu (phút) Diện tích Pic (mAU.s) Trung bình SD RSD % 9,880 9,877 9,849 9,868 9,810 9,784 9,840 0,04 0,40 458,32 462,66 464,90 462,34 468,12 473,96 465,05 5,43 1,17 Độ lệch chuẩn tương đối lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn hỗn hợp 100% có thời gian lưu (≤1,0%) diện tích pic (≤2,0 %) cleisindosid D nằm khoảng cho phép Hệ thống sắc kí ổn định để định lượng cleisindosid D 3.2.3 Khoảng tuyến tính - Mẫu chuẩn cleisindosid D gốc: Cân xác khoảng 5,31 mg cleisindosid D chuẩn vào bình định mức 10 ml, hồ tan định mức vừa đủ ACN-H2O (1-1) Lắc - Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn cleisindosid D: Từ dung dịch chuẩn gốc cleisindosid D, tiến hành pha loãng trình bày Bảng 3.3 để dung dịch chuẩn 24 cleisindosid D có nồng độ khoảng từ 0,106 – 132,80 µg/ml (LOQ đến 250% nồng độ định lượng) Tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn Kết ghi Bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết khảo sát tính tuyến tính Nồng độ % so với ĐL Nồng độ dd cleisindosid D (μg/mL) 0,2 0,106 0,531 3 1,593 2,655 10 5,310 50 26,55 100 53,10 150 79,60 200 106,20 10 250 132,80 Phương trình hồi qui: Y= 8,7991X -2,9716 Hệ số tương quan (r): 0,9998 Hệ số chắn (Y%): - 0,65% STT Diện tích píc (mAU.s) 0,86 5,00 13,4 22,3 45,4 227,2 459,3 688,1 920,2 1182,5 ĐƯỜNG CHUẨN CLEISINDOSID D (0,106-132,8 µg/mL) 1400.000 y = 8.7991x - 2.9716 1200.000 R² = 0.9997 1000.000 800.000 600.000 400.000 200.000 000 -200.0000.000 20.000 40.000 60.000 80.000100.000120.000140.000 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic cleisindosid D Ta có bảng tính giá trị theo kết khảo sát tuyến tính Coefficents Standard error t Start P - value Intercept -2.9715583 3.60556201 -0.8241595 0.43373107 X variablae 8.79912219 0.05787853 152.027397 3.9201E-15 Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0 % Intercept -11.285999 5.34288262 -11.285999 5.34288262 X variablae 8.66565406 8.93259032 8.66565406 8.93259032 25 Nhận xét: - Kết khảo sát cho thấy có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ cleisindosid D khoảng nồng độ khảo sát diện tích pic đáp ứng, với hệ số tương quan r = 0,9998 (r > 0,998) Hệ số chắn Y% đường chuẩn cleisindosid D là: - 0,65% đạt yêu cầu 0.05 => hệ số b đường chuẩn khác khơng có ý nghĩa thống kê 3.2.4 Độ lặp lại - Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng mẫu chuẩn chuẩn bị mục 3.1.1.1 - Chuẩn bị mẫu thử: Thực mẫu thử mục 3.1.1.1 Tiến hành với mẫu thử riêng biệt từ mẫu bột dược liệu - Kết khảo sát độ lặp lại trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại cleisindosid D mẫu thử STT TB SD RSD% Yêu cầu Lượng cân mẫu (g) 0,9832 1,0091 1,0037 1,0025 1,0189 1,0163 Cleisindosid D Diện tích píc (mAU.s) Hàm lượng (%) 450.100 0,270 483.900 0,283 477.854 0,281 473.860 0,279 486.271 0,282 488.893 0,284 0,280 0,005 1,789 RSD%  3,7% Nhận xét: Theo hướng dẫn AOAC 2016 hàm lượng cleisindosid D cleisindosid D lớn 0,1%, nên tỷ lệ % tìm lại cho phép từ 95,0% đến 105,0 % với RSD%  3,7% Từ kết cho thấy RSD% hàm lượng cleisindosid D dung dịch thử 1,789% nhỏ yêu cầu cho phép theo hướng dẫn AOAC 2016, nên phương pháp định lượng cleisindosid D có độ lặp lại đạt yêu cầu 26 3.2.5.Độ đúng: Bảng 3.6.Kết đánh giá độ cleisindosid D mẫu thử C.tonkinesis 50% 50% 50% Diện tích pic (mAU.s) 231.97 229.466 230.508 Lượng chuẩn thêm vào (μg) 121,898 121,898 121,898 100% 100% 100% 467.294 468.299 466.303 243,797 243,797 243,797 200% 200% 200% 903.152 907.003 905.584 731,390 731,390 731,390 Mẫu Lượng thu hồi (mg) 267,006 264,161 265,345 TB RSD% 534,447 535,590 533,321 TB RSD% 1029,791 1034,168 1032,555 TB RSD% Lượng thử sẵn có (μg) 140,027 140,027 140,027 Lượng tìm lại (μg) 126,979 124,133 125,317 280,055 280,055 280,055 254,392 255,535 253,266 280,055 280,055 280,055 749,736 754,113 752,500 %Thu hồi 104,17 101,83 102,80 102,94 1,14 104,35 104,81 103,88 104,35 0,45 102,51 103,11 102,89 102,83 0,29 Nhận xét: Theo hướng dẫn AOAC 2016 hàm lượng cleisindosid D lớn 0,1%, nên tỷ lệ % tìm lại cho phép từ 95,0% đến 105,0 % với RSD%  3,7% Từ kết cho thấy độ thu hồi cleisindosid D nằm giớ hạn cho phép RSD% hàm lượng cleisindosid D dung dịch thử them chuẩn mức nồng độ từ 0,29% đến 1,14% nhỏ yêu cầu cho phép theo hướng dẫn AOAC 2016, nên phương pháp định lượng cleisindosid D có độ thu hồi đạt yêu cầu 3.3 SƠ BỘ ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CLEISTANTHUS 3.3.1 Điều kiện sắc ký - Cột sắc ký: RP 18 (4,6 mm ì 250 mm, àm) Pha động: ACN: Nước Chương trình gradient: STT Thời gian (phút) A 30 12 38 13 38 30 50 31 30 Thời gian phân tích 35 phút 27 B 70 62 62 50 70 Tốc độ dòng 1,0 mL/phút 1,5 mL/phút 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút - Bước sóng: 286 nm - Thể tích tiêm: 20 µL Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng 3.3.2.Tiến hành chiết xuất chạy sắc ký - Mẫu chuẩn cleisindosid D gốc: Cân xác khoảng mg cleisindosid D chuẩn vào bình định mức 10 ml, hoà tan định mức vừa đủ ACN-H2O (1-1) Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm - Mẫu chuẩn làm việc cleisindosid D: Hút xác 1,00 mL dung dịch chuẩn cleisindosid D gốc cho vào bình định mức 10 mL, định mức vừa đủ ACN-H2O (1-1) - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 1,0 g bột dược liệu (đã nghiền mịn, rây qua rây có kích thước mắt rây 0,250 mm) cho vào túi giấy lọc, lắp chiết Soxhlet tiến hành chiết với 50 ml MeOH- H2O (9-1) 2,5h Sau chiết tiến hành chiết xuất, cô dịch chiết xuất đến cắn bể cách thủy Hòa tan cắn ACN- H2O (1-1) định mức vừa đủ vào bình định mức 50,0 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành tiêm sắc ký Tiến hành tiêm sắc ký ghi lại kết Hàm lượng % Cleisindosid D bột dược liệu tính theo cơng thức sau: ST x Cc x D x 100 % HL (%) = SC x M x (100 – x) x 1000 Trong đó: HL: Hàm lượng (%) SC: Diện tích pic cleisindosid D sắc ký đồ từ dung dịch chuẩn ST: Diện tích pic cleisindosid D sắc ký đồ từ dung dịch thử Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml) M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g) DT: Độ pha loãng mẫu thử x: Độ ẩm dược liệu (%) 3.3.3 Kết định lượng - Áp dụng quy trình xây dựng thẩm định trên, tiến hành phân tích xác định hàm lượng cleisindosid D loài thuộc chi Cleistanthus: ✓ Cây Cleistanthus eberhardtii ✓ Cây Cleistanthus Tonkinensis 28 Hình 3.13 Mẫu thử lồi Cleistanthus eberhardtii Hình 3.14 Mẫu thử lồi Cleistanthus tonkinensis Kết hàm lượng Cleisindosid D C eberhardtii C Tonkinesis Sơ tính hàm lượng Cleisindosid D loài : Cleistanthus eberhardtii 0,22% Cleistanthus Tonkinesis 0,28% Nhận xét: - Qua sơ khảo sát hàm lượng Cleisindssid D số loài khác thuộc chi Cách hoa Cleistanthus nhận thấy hàm lượng Cleisindosid D chín lồi Cleistanthus eberhardtii (0,22%) có giá trị gần tương đương với hàm lượng Cleisindosid D loài Cleistanthus tonkinensis (0,28%) - So sánh sắc ký đồ mẫu thử loài Cleistanthus eberhardtii với mẫu thử lồi Cleistanthus tonkinensis có tương đồng thời gian lưu, diện tích pic Cleisindosid D Trên sắc ký đồ, Cleisindosid D tách hoàn toàn khỏi Cleisindosid C 3.4 BÀN LUẬN ❖ Đối tượng nghiên cứu chất Cleisindssid D số loài thuộc chi Cách hoa (Cleistanthus) – hợp chất có tác dụng việc điều trị ung thư chưa có cơng bố nghiên cứu chiết xuất hợp chất từ dược liệu 29 ❖ Qui trình chiết xuất: ➢ Khi xây dựng phương pháp định lượng cleisindosid D số loài thuộc chi Cách hoa Cleistanthus cần chiết kiệt hoạt chất khỏi dược liệu kỹ thuật chiết xuất qui mơ phòng thí nghiệm loại dung mơi độc hại ➢ Sử dụng hệ dung mơi chiết xuất MeOH – H2O (9-1) có ưu điểm chiết tối đa lượng Cleisindosid D qui trình chiết xuất bao gồm giai đoạn đến cắn, hệ dung mơi MeOH-H2O (9-1) có ưu điểm bay nhanh ➢ Phương pháp chiết Shoxlet áp dụng chiết kiệt lượng Cleisindosid D có dược liệu ❖ Qui trình định lượng cleisindosid D HPLC: - Cột RP 18 (4,6 mm × 250 mm, µm) sử dụng đảm bảo tách chất lại thơng dụng phòng thí nghiệm dung mơi acetonitril nước dễ kiếm, rẻ tiền, độc hại chương trình gradient đảm bảo tách tốt chất dược liệu với thời gian phân tích ngắn, tiết kiệm dung môi - Phương pháp định lượng cleisindosid D khảo sát thẩm định đầy đủ nhằm đưa phương pháp phân tích đáng tin cậy, dễ sử dụng phòng phân tích, sử dụng cột RP 18 dung môi hỗn hợp acetonitril nước thơng dụng, khơng đắt tiền nên phân tích phòng kiểm nghiệm ❖ Sơ xác định hàm lượng cleisindosid D số loài thuộc chi Cleistanthus - Các chi Cleistanthus lồi đặc hữu có Việt Nam nên chưa có nghiên cứu lồi giới Tại Việt Nam, có đề tài triển khai để phân tích cleisindosid D dịch chiết từ thuộc chi Cách hoa, dừng lại phát píc chất Vì vậy, kết mà chúng tơi nghiên cứu cơng trình nghiên cứu mang tính mới, lần có nghiên cứu bước đầu đưa kết hàm lượng cleisindosid D số loài thuộc chi Cách hoa (Cleistanthus) 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN: ❖ Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Cleisindosid D số loài thuộc chi cách hoa (Cleistanthus) HPLC: ➢ Qui trình chiết xuất: Luận văn xây dựng quy trình chiết xuất tối ưu Cleisindosid D từ loài thuộc chi Cách hoa Với quy trình định lượng, sử dụng kỹ thuật chiết soxhlet nhằm đảm bảo chiết kiệt hoạt chất khỏi dược liệu ➢ Qui trình định lượng cleisindosid D: Xây dựng thành cơng quy trình định lượng Cleisindisid D số loài thuộc chi Cách Hoa (Cleistanthus) - Cột sắc ký: RP 18 (4,6 mm × 250 mm, µm) Pha động: ACN: Nước Chương trình gradient: STT Thời gian (phút) A 30 12 38 13 38 30 50 31 30 Thời gian phân tích 35 phút B 70 62 62 50 70 Tốc độ dòng 1,0 mL/phút 1,5 mL/phút 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút - Bước sóng: 286 nm - Thể tích tiêm: 20 µL - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng ➢ Thẩm định phương pháp xây dựng: Về độ đặc hiệu phân huỷ điều kiện khắc nghiệt, dung dịch mẫu thử ổn định không xuất tạp chất phân huỷ Giới hạn định lượng cleisindosid D 0,106 mg/mL, khoảng tuyến tính từ 0,106 – 132,80 với hệ số tương quan 0,9998 > 0,998 hệ số chắn Y%= - 0,65% nhỏ 2,7% Độ lặp lại độ xác trung gian có RSD% < 3,7% Độ thu hồi nằm khoảng từ 95,0 % đến 105,0 % ❖ Sơ định lượng hàm lượng Cleisindosid D số loài thuộc chi Cách hoa (Cleistanthus) Loài Cleistanthus Eberhatii chứa hàm lượng cleisindosid D 0,22% Loài Cleistanthus Tonkinensis chứa hàm lượng cleisindosid D 0,28% 31 4.2 ĐỀ XUẤT ❖ Tiếp tục áp dụng phương pháp HPLC xây dựng thẩm định để định lượng cleisindosid D số loài thuộc chi Cleistanthus ❖ Tiếp tục nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở cho thuộc chi Cleistanthus làm nguồn dược liệu chiết xuất cao định chuẩn làm nguyên liệu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích - Tập 2, tr.123-200, NXB Y học, Hà Nội Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết xuất ứng dụng kiểm nghiệm thuốc độc chất Nhà xuất Y Học, Hà Nội pp Bộ Y tế (2010), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr 158-179 Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y Học, Hà Nội, pp tr 682-683 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, pp Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam - Quyển II, tr.231-234, NXB Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Viết Tựu, Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, tr 320-325 Viện dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội Trịnh Thị Thanh Vân (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thuộc họ Thầu dầu Việt Nam, tr 5-148, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội Tiếng Anh 10 “Alkaloids” (Chinese), http://www.zhong-yao.net/zy/gy/hx/ 200803/ 106966.html.57 11 Amid, Salim RJ, Adenan M (2010) The Factors Affecting the Extraction Conditions for Newroprotective Activity of Centella asiatica evaluated by Metal Chelating Activity Assay J Appl Sci 10: 837-842 12 Dhanani T, Shah S, Gajbhiye NA, Kumar S (2013) Effect of extraction methods on yield, phytochemical constituents and antioxidant activity of Withania somnifera Arab J Chem 13 H Kathriarachchi et al (2006), “Phylogenetics of tribe Phyllantheae (Phyllanthaceae; Euphorbiaceae sensu lato) based on nrITS and 33 plastid matK DNA sequence data", American Journal of Botany, 93(4), pp 637-655.11 14 H Kathriarachchi, P Hoffmann, R Samuel, K J Wurdack, and M W Chase (2005), “Molecular phylogenetics of Phyllanthaceae inferred from five genes (plastid atpB, matK, 3′ndhF, rbcL, and nuclear PHYC)”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 36(1), pp 112–134.10 15 Handa SS, Khanuja SPS, Longo G, Rakesh DD (2008)” Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants”, (1stedn), no 66 Italy: United Nations Industrial Development 16 ICH, Validation of Analytical Procedures 2005 17 Kaufmann B and Christen P (2002) Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurized solvent extraction Phytochem Anal 13: 18 Lang, Q., Wai, C.M., 2001 Supercritical fluid extraction in herbal and natural product studies—a practical review Talanta 53 (4), 771–782 19 Naudé Y, De Beer WHJ, Jooste S, Van Der Merwe L, Van Rensburg SJ (1998) Comparison of supercritical fluid extraction and Soxhlet extraction for the determination of DDT, DDD and DDE in sediment Water SA 24: 205-214 20 Patil, Sachin BS, Wakte PS, Shinde DB (2013) Optimization of supercritical fluid extraction and HPLC identification of wedelolactone from Wedelia calendulacea by orthogonal 21 R Samuel et al (2005), “Molecular phylogenetics of phyllanthaceae: Evidence from plastid matK and nuclear PHYC sequences", American Journal of Botany, 92(1), pp 132-141.12 22 S I Berger and R Iyengar, “Network analyses in systems pharmacology,” Bioinformatics, vol 25, no 19, pp 2466–2472, 2009.127 23 S Krief, M T Martin, P Grellier, J Kasenene, and T Se´venet, “Novel antimalarial compounds isolated in a survey of self34 medicative behavior of wild chimpanzees in Uganda,” Antimi- crobial Agents and Chemotherapy, vol 48, no 8, pp 3196–3199, 2004.19 24 The Angiosperm Phylogeny Group (2009), "An update of the Angiosperm Phylogeny Group Classification for the orders and families of flowering plants: APG III", Botanical Journal of the Linnean Society, 161(2), pp 105-121.5 25 The Bristish Pharmacopoeia 2016 26 The United State Pharmacopoeia 40 27 Trusheva B, Trunkova D, Bankova V (2007) Different extraction methods of biologically active components from propolis: a preliminary study Chem Cent J 13 28 Trusheva B, Trunkova D, Bankova V (2007) Different extraction methods of biologically active components from propolis: a preliminary study Chem Cent J 13 29 V Trinh Thi Thanh et al (2012), “Cytotoxic Lignans from Fruits of Cleistanthus indochinensis: Synthesis of Cleisindosid D Derivatives”, Journal of Natural Products, 80(8-9), pp 695-702.13 30 V Walsh and J Goodman, “Cancer chemotherapy, biodiversity, public and private property: the case of the anti-cancer drug Taxol,” Social Science and Medicine, vol 49, no 9, pp 1215–1225, 1999 36 31 WHO (2017), “World Health Statistics 2017: Monitoring health for the SDGs.” 35 ... tài: "Xây d ng phương pháp định lượng Cleisindosid D số loài thuộc chi cách hoa Cleistanthus HPLC" với mục tiêu: Xây d ng thẩm định phương pháp định lượng Cleisindosid D số loài thuộc chi Cách hoa. .. loài thuộc chi Cleistanthus Áp d ng phương pháp xây d ng mục 2.2.2 để định lượng cleisindosid D số loài chi cách hoa 2.2.3.1 Định lượng cleisindosid D số loài chi cách hoa phương pháp HPLC Tiến... D ỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ĐOÀN Mã sinh viên: 1401142 XÂY D NG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLEISINDOSID D TRONG QUẢ CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ỢC