XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG VINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG VINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI – 2019 MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Công thức cấu tạo đặc tính hóa lý natri hyaluronat 1.1.2 Tác dụng natri hyaluronat 1.1.3 Công thức bào chế thuốc nhỏ mắt chứa SH 1.1.4 Công thức số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH thị trường 1.1.5 Tình hình nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng natri hyaluronat…… 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 12 1.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS 12 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 15 CHƯƠNG II 22 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 22 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 23 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.3.1 Phương pháp HPLC 24 2.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV - VIS 25 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 27 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 29 CHƯƠNG III 31 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31 3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 31 3.1.1 Sắc ký lọc gel (GFC) 31 3.1.2 Sắc ký pha đảo (RP – HPLC) 33 3.1.3 Quang phổ hấp thụ UV – VIS 38 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SH TRONG THUỐC NHỎ MẮT ESKAR TEAR 42 3.2.1 Sắc ký lọc gel (GFC) 42 3.2.2 Sắc ký pha đảo (RP – HPLC) 49 3.2.3 Quang phổ hấp thụ UV - VIS 55 3.3 ÁP DỤNG CÁC QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG SH TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT 59 3.3.1 Xác định hàm lượng SH GFC 59 3.3.2 Xác định hàm lượng SH RP - HPLC 61 CHƯƠNG IV 63 BÀN LUẬN 63 4.1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV - VIS 63 4.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 63 4.3 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG SH TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM 66 4.4 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG 66 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 68 KẾT LUẬN 68 ĐỀ XUẤT 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 Tiếng Việt 70 Tiếng Anh 70 Trang Web 72 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN: Acetonitril AOAC Hiệp hội nhà hóa học phân tích (Association of official analytical chemists cs: Cộng DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector) GFC Sắc ký lọc gel (Gel filtration chromatography) HA: Acid hyaluronic HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) ICH: Tổ chức hòa hợp quốc tế (international conference on harmonisation) Mw: Trọng lượng phân tử (Molecular weight) NSAIDS: Thuốc chống viêm không steroid (Non - steroid anti - inflammtory drugs) NSX: Nhà sản xuất PA: Tinh khiết dùng để phân tích (Purity analysis) Quang phổ Quang phổ hấp thụ hấp thụ UV – VIS RP - HPLC Sắc ký pha đảo (Reversed – phase high performance liquid chromatography) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SEC: Sắc ký rây phân tử (Size exclusion chromatography) SH: Natri hyaluronat (Sodium hyaluronate) SKĐ: Sắc ký đồ STT: Số thứ tự TLTK: Tài liệu tham khảo DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm dung dịch thuốc nhỏ mắt thị trường Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch natri perclorat tới thời gian lưu hệ số As pic SH 36 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian Carbazol phản ứng đến độ hấp thụ dung dịch chuẩn 39 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng thể tích dung dịch Carbazol phản ứng đến độ hấp thụ dung dịch chuẩn 40 Bảng 3.5 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống GFC 44 Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính GFC 45 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ GFC 47 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ xác GFC 48 Bảng 3.9 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống RP - HPLC 51 Bảng 3.10 Kết khảo sát khoảng tuyến tính RP - HPLC 52 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ RP - HPLC 53 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ xác RP - HPLC 55 Bảng 3.13 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống quang phổ UV - VIS 56 Bảng 3.14 Kết khảo sát tính đặc hiệu quang phổ UV – VIS 57 Bảng 3.15 Kết so sánh giá trị trung bình hàm lượng SH thuốc nhỏ mắt Eskar tears GFC RP – HPLC 58 Bảng 3.16 Kết khảo sát hàm lượng SH GFC 59 Bảng 3.17 Kết khảo sát hàm lượng SH RP - HPLC 61 Bảng 4.18 So sánh phương pháp xây dựng với phương pháp công bố 64 Bảng 4.19 Kết khảo sát định lượng SH số chế phẩm GFC RP - HPLC 66 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu tạo phân tử acid hyaluronic Hình 2.2 Cơ chế phản ứng quy trình định lượng SH phương pháp quang phổ UV – VIS 26 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan pH pha động với hệ số kéo đuôi As pic SH 31 Hình 3.4 Phổ UV – VIS với detector DAD pic SH tách cột gel 32 Hình 3.5 SKĐ SH dung dịch mẫu chuẩn (a) dung dịch mẫu thử (b) tách phương pháp GFC 33 Hình 3.6 SKĐ natri hyaluronat khảo sát cột C8 34 Hình 3.7 SKĐ natri hyaluronat khảo sát cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm; µm) 35 Hình 3.8 SKĐ natri hyaluronat khảo sát cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm; µm) với hệ pha động hệ pha động 36 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ pha động với hệ số As pic SH 36 Hình 3.10 SKĐ dung dịch mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b) sử dụng cột C18 38 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan thời gian phản ứng Carbazol đến độ hấp thụ dung dịch chuẩn 39 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan thể tích Carbazol phản ứng đến độ hấp thụ dung dịch chuẩn 40 Hình 3.13 SKĐ dung dịch chuẩn (a), thử (b), thử thêm chuẩn (c) placebo (d) GFC 44 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic SH GFC 46 Hình 3.15 SKĐ dung dịch chuẩn (a), thử (b), thử thêm chuẩn (c) placebo (d) RP - HPLC 51 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic SH RP - HPLC 53 Hình 3.17 Sắc ký đồ Sanlein (a), Hylene (b) Samca (c) GFC 60 Hình 3.18 Sắc ký đồ Sanlein (a), Hylene (b) Samca (c) RP - HPLC 62 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng natri hyaluronat dung dịch thuốc nhỏ mắt quang phổ sắc ký lỏng hiệu cao”, làm việc nghiêm túc, cố gắng, nỗ lực thân, tơi nhận nhiều khích lệ từ phía gia đình, thầy cơ, đồng nghiệp, bạn bè nhà trường Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới: PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh – người thầy tận tình dìu dắt bảo tơi suốt q trình học tập thực đề tài Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: ThS Trần Thúy Hạnh – người tận tình bảo đóng góp nhiều ý kiến q báu giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh chị em khoa Dược lý, ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Đã hỗ trợ tạo điều kiện cho q trình học tập nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt thời gian học tập trường Từ đáy lòng mình, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn vơ hạn tới gia đình thân yêu tôi, cảm ơn người bạn thân thiết khích lệ, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Với vốn kiến thức hạn chế thân, chắn luận văn nhiều thiếu sót Vì vậy, mong thầy cô bỏ qua Tôi hy vọng nhận ý kiến đóng góp quý báu quý thầy cô nhằm nâng cao kiến thức thân phục vụ tốt cho trình công tác sau Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 03 năm 2019 Nguyễn Thị Hồng Vinh ĐẶT VẤN ĐỀ Natri hyaluronat (SH) muối natri acid hyaluronic, có chất glycosaminoglycan bao gồm nhiều phân tử disaccharid D – glucuronic acid N – acetyl – D – Glucosamine liên kết với [20],[24] SH chiết xuất từ vi khuẩn mào gà Trong thể, SH hình thành nguyên bào sợi phân bố rộng rãi mô liên kết, biểu mô thần kinh Nồng độ SH thể tăng cao trường hợp viêm hoạt dịch giảm dị hóa suy thận [20] Trong mỹ phẩm, SH giúp làm giảm nếp nhăn tăng cường độ ẩm cho da có khả giữ nước Trong y học, SH dùng làm thuốc bơi ngồi để làm tăng khả hấp thu qua da hoạt chất phối hợp [15], dùng điều trị chứng đau thối hóa khớp gối cho người dùng liệu pháp không dùng thuốc trường hợp dùng thuốc giảm đau thông thường khác khơng có hiệu [5] Đặc biệt SH ngày sử dụng rộng rãi bệnh lý mắt phẫu thuật cấy ghép giác mạc, đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp bong võng mạc, điều trị triệu chứng khô mắt, làm dịu bôi trơn bề mặt mắt, tăng cường độ ẩm cho mắt…[15] Hiện nay, có số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH đăng ký lưu hành Việt Nam như: Hylene, Unihy, Salein …Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng chế phẩm chứa SH, đặc biệt chế phẩm thuốc nhỏ mắt gặp nhiều khó khăn ảnh hưởng có mặt protein, enzym [21] Mặt khác cấu trúc SH polymer có phân tử lượng lớn nên việc chia tách phân tử dung dịch gặp nhiều khó khăn so với hợp chất khác Xuất phát từ lý nhằm mục đích tìm phương pháp định lượng SH thuốc nhỏ mắt có độ xác cao, ổn định phù hợp với điều kiện sở vật chất nhiều phòng thí nghiệm nên chúng tơi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng natri hyaluronat dung dịch thuốc nhỏ mắt quang phổ sắc ký lỏng hiệu cao “ Mục tiêu đề tài bao gồm: ... CỨU 22 2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THI T BỊ 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 22 2.1.3 Dụng cụ, thi t bị 23 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN... tới gia đình thân u tơi, cảm ơn người bạn thân thi t khích lệ, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Với vốn kiến thức hạn chế thân, chắn luận văn nhiều thi u sót Vì vậy, mong thầy cô bỏ qua Tôi hy vọng... phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ - Các yếu tố thuộc thi t bị: Với chất bước sóng khác hệ số hấp thụ thường khác nhau, khả tạo chùm tia đơn sắc thi t bị ảnh hưởng đến độ hấp thụ dung dịch, bước