PHẠM THỊ mát TỔNG hợp và THỬ tác DỤNG SINH học MUỐI NATRI 2 (CURCUMIN o YL)ETHYL HEMISUCCINAT KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ hà nội – 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM THỊ MÁT TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MUỐI NATRI 2(CURCUMIN-O-YL)ETHYL HEMISUCCINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM THỊ MÁT MÃ SINH VIÊN: 1501326 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MUỐI NATRI 2(CURCUMIN-O-YL)ETHYL HEMISUCCINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hải NCS Phạm Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Viện CNDPQG HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải, NCS Phạm Thị Hiền - người thầy trực tiếp hướng dẫn, theo sát, tận tình truyền đạt, động viên em suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tất thầy cơ: GS.TS Nguyễn Đình Luyện, TS Đào Nguyệt Sương Huyền, TS Nguyễn Văn Giang, NCS Nguyễn Thị Ngọc anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em nghiên cứu Bộ môn Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội truyền thụ cho em nhiều kiến thức, kỹ quý báu khoảng thời gian em học tập, rèn luyện trường Trong trình thực khóa luận, em nhận giúp đỡ cán thuộc Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Phịng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, em xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình¸ anh chị, bạn nhóm nghiên cứu – người ln bên cạnh, quan tâm, giúp đỡ, tiếp thêm động lực để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Do kiến thức, kỹ thân em hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận nhận xét, góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2020 Sinh viên Phạm Thị Mát MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung curcumin 3 1.1.1 Cấu trúc phân tử tính chất lý hóa curcumin 1.1.2 Vai trò curcumin sức khỏe 1.1.3 Các hạn chế curcumin 1.2 Các phương pháp hóa học cải thiện độ tan sinh khả dụng curcumin 1.3 Lựa chọn phương pháp nghiên cứu tổng hợp thử sinh học 1.3.1 Lựa chọn vị trí biến đổi 1.3.2 Lựa chọn nhóm thân nước 1.3.3 Lựa chọn phép thử hoạt tính sinh học CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị, dụng cụ 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Tổng hợp hóa học 16 2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 16 2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học 16 2.3.4 Thử hoạt tính sinh học 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) 23 23 3.1.1 Tổng hợp S-1 theo tài liệu tham khảo 23 3.1.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp S-1 (Hình 3.2) 25 3.2 Xây dựng quy trình tổng hợp muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-3) 26 3.2.1 Giai đoạn acyl hóa tạo S-2 từ S-1 26 3.2.2 Giai đoạn tạo muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-3) 31 3.2.3 Sơ đồ quy trình tổng hợp S-3 (Hình 3.6) 32 3.2.4 Xác định cấu trúc S-3 34 3.3 Thử hoạt tính sinh học 36 3.3.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH 36 3.3.2 Thử hoạt tính ức chế sinh NO 36 3.3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 37 3.4 Bàn luận 38 3.4.1 Về tổng hợp hóa học 38 3.4.2 Về xác định cấu trúc 40 3.4.3 Về thử hoạt tính sinh học 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic resonance) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) AR Tinh khiết phân tích (Analytical reagent) CTCT Cơng thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DCM Dicloromethan DMEM Môi trường nuôi cấy Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) DMF Dimethyl formamid DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị carbon FBS Huyết bào thai bò (Fetal bovine serum) g Gam h Giờ Hela Human cervix carcinoma (Ung thư tử cung người) HepG2 Human hepatocellular carcinoma (Ung thư gan người) HL-60 Human leukemia (Ung thư bạch cầu người) HPLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at 50%) IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại) K562 Human myelogenous leukemia (Ung thư bạch cầu cấp người) LD50 Liều chết 50% động vật thí nghiệm LD100 Liều thấp gây chết 100% động vật thí nghiệm L-NMMA NG-methyl-L-arginin acetat Log P Hệ số phân bố dầu nước LPS Lipopolysaccharid MCF7 Human breast carcinoma (Ung thư vú người) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, - diphenyltetrazolium PEG Polyethylen glycol Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) S-1 mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin S-2 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat S-3 Natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat SA Khả trung hịa gốc oxy hóa tự SC50 Nồng độ trung hòa 50% gốc tự (Scavenging concentration at 50%) SKLM Sắc ký lớp mỏng SRB Sulforhodamin B RAW 264.7 Dòng đại thực bào chuột 264.7 t°nc Nhiệt độ nóng chảy SOD Chất chống oxy hóa phân giải dây chuyền (superoxid dismutase) TCA Trichloracetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số tiền thuốc succinat Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu – hóa chất 14 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ – thiết bị 14 Bảng 3.1 Kết khảo sát thời gian phản ứng tạo S-2 27 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol anhydrid succinic : S-1 .28 Bảng 3.3 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo S-2 28 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) S-3 34 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) S-3 34 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) S-3 35 Bảng 3.7 Kết phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) S-3 35 Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa 36 Bảng 3.9 Khả ức chế tế bào RAW 264.7 sinh NO 37 Bảng 3.10 Tác động mẫu nghiên cứu đến sống sót tế bào RAW 264.7 37 Bảng 3.11 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư .37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo curcumin Hình 1.2 Sự phân hủy curcumin tác dụng ánh sáng Hình 1.3 Các vị trí biến đổi cấu trúc curcumin .7 Hình 1.4 Tiền thuốc artemisnin .10 Hình 1.5 Tiền thuốc hydrocortison .10 Hình 1.6 Phản ứng tạo curcumin diethyl disuccinat 11 Hình 1.7 Phản ứng tạo dẫn chất succinat curcumin 11 Hình 1.8 Phản ứng tạo dẫn chất S-2 12 Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-3) .12 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp S-3 .16 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp S-1 .23 Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp S-1 quy mô g/mẻ 25 Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp S-2 .26 Hình 3.4 Sơ đồ quy trình tổng hợp S-2 30 Hình 3.5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp S-3 .31 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình tổng hợp S-3 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin polyphenol có tinh bột nghệ (Curcuma longa) với hai dẫn chất demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin gọi chung curcuminoid - dược phẩm sử dụng rộng rãi Hiện nay, nhiều nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng chứng minh curcumin có tác dụng dược lý đa dạng: chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, làm lành vết thương, làm liền sẹo… [2], [29] Tuy nhiên để curcumin đạt lợi ích tiềm ứng dụng phổ biến lâm sàng cịn gặp phải số thách thức: độ tan curcumin nước pH acid sinh lý thấp, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng sử dụng theo đường uống dẫn đến sinh khả dụng curcumin thấp [31] Để cải thiện sinh khả dụng curcumin người ta sử dụng phương pháp vật lý: hệ thống phân phối thuốc liposome, micel, tiểu phân nano… phương pháp hóa học dựa khung curcuminoid có sẵn: biến đổi nhóm OH, khung anken Kết bán tổng hợp dẫn chất nhằm tăng độ tan curcumin cho thấy dẫn chất cấu trúc cịn nhóm – OH phenol cho hoạt tính sinh học tốt [32] Gần đây, nhóm nghiên cứu mơn Cơng nghiệp Dược tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH, kháng tế bào ung thư HepG2, kết thu tốt curcumin, nhiên độ tan chất so với curcumin tăng khơng đáng kể [4] Xuất phát từ kết đó, nhiều nghiên cứu thực việc gắn thêm nhóm thân nước như: phosphat, sulfat vào dẫn chất S-1 giúp cải thiện độ tan tạo hợp chất có hoạt tính tốt hơn, sinh khả dụng cao curcumin [8] Trong ngành Dược, số hoạt chất sử dụng dạng muối natri ester succinat với ưu điểm: tương đối bền môi trường chuyển hóa, cải thiện đáng kể độ tan, độ ổn định, sinh khả dụng thuốc mẹ Một số ví dụ kể đến cloramphenicol, oxazepam, hydroxydion, methylprednisolone…[21] Trong đề tài trước, DS Đặng Thị Hải Yến tổng hợp thử in-vitro tác dụng chống oxy hóa, chống viêm ức chế tế bào ung thư dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2) Kết S2 có tác dụng tốt so với curcumin ban đầu [9] Từ định hướng trên, tiếp tục nghiên cứu tổng hợp dẫn chất muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat thử in-vitro hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp Khóa luận thực đề tài “Tổng hợp thử tác dụng sinh học muối natri 2(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat” với hai mục tiêu chính: 14 Arshad L., et al (2017), "An overview of structure–activity relationship studies of curcumin analogs as antioxidant and anti-inflammatory agents", Future Medicinal Chemistry, 9(6), pp.605-626 15 Changtam C., et al (2010), "Curcuminoid analogs with potent activity against Trypanosoma and Leishmania species", European Journal of Medicinal Chemistry, 45(3), pp.941-956 16 Cheng A.L., et al (2001), “Phase I clinical trial of curcumin, a chemopreventive agent, in patients with high-risk or pre-malignant lesions”, Anticancer Res., 21(4B), pp.2895-2900 17 Fan X., et al (2013), “The clinical applications of curcumin: current state and the future”, Curr Pharm Des., 19(11), pp.2011-2031 18 Feng J.Y, Liu Z.Q (2009), “Phenolic and enolic hydroxyl groups in curcumin - which plays the major role in scavenging radicals?” J Agric Food Chem., 57(22), pp.11041-11046 19 Han S (2007), “Method for preparing hydrocortisone sodium succinate”, Patents, CN101050229A 20 Heger M., et al (2014), “The molecular basis for the pharmacokinetics and pharmacodynamics of curcumin and its metabolites in relation to cancer”, Pharmacological reviews, 66(1), pp.222-307 21 Jeffery H., Valentino J.S (2007), “Prodrugs and parenteral drug delivery”, Prodrugs: challenges and reward, Valentino J.S., et al, Springer, 1, pp.220-263 22 Jornada D.H., et al (2015), "The Prodrug Approach: A Successful Tool for Improving Drug Solubility", Molecules, 21(1), pp.42 23 Lao C.D., et al (2006), “Dose escalation of a curcuminoid formulation”, BMC Complementary and Alternative Medicine, 6(1), pp.1-4 24 Lestari M.L.A.D., Indrayanto G (2014), "Chapter Three - Curcumin", Profiles of Drug Substances, Excipients and Related Methodology, Harry G Brittain, Academic Press, 39 25 Litwinienko G., Ingold K.U (2004), “Abnormal solvent effects on hydrogen atom abstraction Resolution of the curcumin antioxidant controversy The role of sequential proton loss electron transfer”, The Journal of Organic Chemistry, 69(18), pp.5888-5896 26 Pan M.H., et al (1999), “Biotransformation of curcumin through reduction and glucuronidation in mice”, Drug Metab Dispos, 27 (4), pp.486–494 27 Prasad S., et al (2014), “Curcumin, a component of golden spice: From bedside to bench and back”, Biotechnology Advances, 32(6), pp.1053-1064 28 Priyadarsini K.I (2014), "The chemistry of curcumin: from extraction to therapeutic agent", Molecules, 19(12), pp.20091-20112 29 Pulido-Moran M., et al (2016), "Curcumin and Health", Molecules, 21(3), p.264 30 Salem M., et al (2014), “Curcumin, a promising anti-cancer therapeutic: a review of its chemical properties, bioactivity and approaches to cancer cell delivery”, RSC Advances, 4(21), pp.10815-10829 31 Sharma R.A., et al (2005), “Curcumin: the story so far”, European journal of cancer, 41(13), pp.1955-1968 32 Shishodia S., et al (2005), "Curcumin: getting back to the roots", Ann N Y Acad Sci, 1056, pp.206-17 33 Shoba G., et al (1998), “Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers”, Planta Med, 64 (4), pp.353–356 34 Simon P.M., Clive G.W (2011) “Drug absorption, distribution, metabolism and excretion”, Pharmaceutical chemistry, pp.165 35 Tønnesen H.H., Karlsen J (1985), “Studies on curcumin and curcuminoids”, Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung, 180(5), pp.402-404 36 Vyas A., et al (2013), "Perspectives on new synthetic curcumin analogs and their potential anticancer properties", Current pharmaceutical design, 19(11), pp.2047 37 Wichitnithad W., et al (2011), “Synthesis, Characterization and Biological Evaluation of Succinate Prodrugs of Curcuminoids for Colon Cancer Treatment”, Molecules, 16(2), pp.1888–1900 38 Wichitnithad W., et al (2011), “Effects of Different Carboxylic Ester Spacers on Chemical Stability, Release Characteristics, and Anticancer Activity of MonoPEGylated Curcumin Conjugates”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 100(12), pp.5206–5218 39 Ying L., et al (2018), “Artemisinin derivatives and analogues”, Artemisinin- based and other antimalarials, pp.183 40 Yan X., et al (2005), “Artesunate salt and its preparation process and use”, Patents, CN1699370A 41 Zhang F., et al (2011), “A novel solubility-enhanced curcumin formulation showing stability and maintenance of anticancer activity”, Journal of pharmaceutical sciences, 100(7), pp.2778-2789 PHỤ LỤC Phụ lục Phổ MS (-) S-3 Phụ lục Phổ MS (+) S-3 Phụ lục Phổ IR S-3 Phụ lục Phổ 1H-NMR S-3 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn S-3 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn tiếp S-3 Phụ lục Phổ 13C-NMR S-3 Phụ lục Phổ 13C-NMR giãn S-3 Phụ lục Phổ 13C-NMR giãn S-3 sau xử lý từ liệu gốc Phụ lục 10 Phổ 13C-NMR giãn tiếp S-3 Phụ lục Phổ MS (-) S-3 Phụ lục Phổ MS (+) S-3 Phụ lục Phổ IR S-3 97 96 94 92 1062.62 90 88 552.34cm-1 2939.81 86 %T 84 806.08cm-1 930.10 1457.04 82 855.67cm-1 80 78 1030.46cm-1 972.25cm-1 1723.20cm-1 76 3414.01cm-1 1167.32cm-1 74 1627.88cm-1 1413.24cm-1 72 c m -1 70 1285.72cm-1 1136.78cm-1 1250 1000 1514.81cm-1 68 4000 3500 3000 2500 2000 1750 cm-1 1500 750 500 400 Phụ lục Phổ 1H-NMR S-3 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn S-3 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn tiếp S-3 Phụ lục Phổ 13C-NMR S-3 Phụ lục Phổ 13C-NMR giãn S-3 Phụ lục Phổ 13C-NMR giãn S-3 sau xử lý từ liệu gốc Phụ lục 10 Phổ 13C-NMR giãn tiếp S-3 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - PHẠM THỊ MÁT MÃ SINH VIÊN: 1501 326 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MUỐI NATRI 2( CURCUMIN -O- YL)ETHYL HEMISUCCINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng... natri 2- (curcumin- O- yl)ethyl hemisuccinat thử in-vitro hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp Khóa luận thực đề tài ? ?Tổng hợp thử tác dụng sinh học muối natri 2( curcumin -O- yl)ethyl hemisuccinat? ?? với... trình tổng hợp S -2 30 3 .2. 2 Giai ? ?o? ??n t? ?o muối natri 2- (curcumin- O- yl)ethyl hemisuccinat (S-3) 3 .2. 2.1 T? ?o S-3 từ S -2: Tiến hành phản ứng t? ?o muối natri tác nhân natri bicarbonat dung mơi aceton