Nghiên Cứu Phân Lập Và Thiết Kế Vector Chuyển Gen SSIV Mã Hóa Enzyme Starch Synthase Tăng Cường

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - NGUYỄN MẬU HƢNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘThạc GIÁO Luận văn sỹ DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ Mậu Hưng Nguyễn CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420114 Học viện: Hƣớng dẫn khoa học: Nguyễn Mậu Hƣng TS Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2016 LỜI CAM ĐOAN Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn hoàn toàn hoàn thiện quá trình nghiên c ứu khoa học thân hướng dẫn trực tiếp TS Phạm Bích Ngọc v ới cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Các số liệu hình ảnh, kết trình bày, luận văn trung thực, không chép tài liệu, công trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan mình trước hội đồng khoa học Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hƣng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tơi hồn thành luận văn này: TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật Viện Công nghệ Sinh học, hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài PGS.TS Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học bảo tận tình chuyên môn, theo sát thí nghiệm tơi để có lời khuyên bổ ích kịp thời ThS Lê Thu Ngọc, CN Nguyễn Khắc Hưng, CN Phạm Thanh Tùng giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô giáo Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập vừa qua Bằng tình cảm chân thành, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng MỤC LỤC MỞ ĐẦU 11 Đặt vấn đề 11 Mục đích nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 Ý nghĩa khoa học 13 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 Tổng quan tinh bột sinh tổng hợp tinh bột 14 1.1.1 Giới thiệu tinh bột 14 1.1.2 Cấu trúc tinh bột 15 1.1.3 SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT 16 1.1.4 HÌNH DẠNG TINH BỘT 17 1.1.5 Các loại hạt tinh bột hay gặp 17 1.1.6 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột gen liên quan 18 1.1.7 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến trình trao đổi tinh bột 21 1.2 Cây sắn tình hình sản xuất sắn giới Việt Nam 22 1.3 Rễ tơ ứng dụng nuôi cấy rễ tơ sản xuất protein tái tổ hợp 26 1.4 Giới thiệu Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ tế bào thực vật 28 1.5 Cơ chế chuyển gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 29 1.6 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 30 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu , hóa chất thiết bị 32 2.1.1 Thực vật 32 2.1.2 Chủng khuẩn, vector cặp mồi sử dụng 32 2.1.3 Hóa chất 33 2.1.4 Thiết bị 33 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.2 Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV 34 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 34 2.2.2 Phản ứng RT-PCR 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 2.2.3 Tách dòng sản phẩm vector pENTR™/D-TOPO 36 2.2.4 Kiểm tra khuẩn lạc phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc 37 2.2.5 Tách chiết plasmid 38 2.2.6 Xác định trình tự so sánh trình tự gen thu đƣợc với trình tự tƣơng ứng GenBank 39 2.2.7 Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV kỹ thuật Gateway 39 2.2.8 Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 42 2.2.9 Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen môi trƣờng chọn lọc 43 2.2.10 Phƣơng pháp xử lí số liệu 43 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase sắn 44 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 44 3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV sắn tổng hợp cDNA 44 3.1.3 Phân lập, tách dịng, giải trình tự gen SSIV sắn 45 3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tƣơng ứng 46 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV kỹ thuật Gateway 46 3.2.2 Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen thiết kế 47 3.3 Kết chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV 48 3.5 Phân tích dịng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV kỹ thuật PCR 50 3.6 Phân tích chuyển gen SSIV kỹ thuật RT-PCR 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 KẾT LUẬN: 55 ĐỀ NGHỊ: 55 Tài Liệu Tham Khảo 56 Phụ Lục: Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc phân tử amylopectin amylose 15 Hình Quá trình sinh tổng hợp tinh bột enzyme liên quan 19 Hình Cây Sắn 23 Hình Sản lƣợng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not defined Hình Tỷ lệ sản lƣợng sắn nƣớc giới, 2012Error! Bookmark not defined Hình biến tiện ích dựa sở phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu vị trí điểm chuyên biệt DNA phage vi khuẩn đƣợc gọi điểm gắn (attachment sites) Với kỹ thuật này, nhiều gen đích di chuyển từ entry clone vào vector đích biểu theo chiều khung đọc bƣớc thao tác mà sử dụng enzyme cắt giới hạn pK7WG2D vector thuộc hệ thống Gateway với cấu trúc gồm vùng chứa cassette attR1ccdB-attR2 Vì vậy, sản phẩm phản ứng LR plasmid có chứa vị trí tái tổ hợp mang gen đích có chiều mong muốn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 46 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng Thành phần bƣớc thực phản ứng LR đƣợc thực theo hƣớng dẫn Kit Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix Invitrogen với vector đích pK7WG2D entry clone vector pENTR/SSIV thiết kế thành công Sản phẩm phản ứng đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E coli One Shot TOP10 chọn lọc môi trƣờng có bổ sung Spectinomycin 100 µg/ml Để sàng lọc dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV mong muốn, thực phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F SSIV-Frag_R khuếch đại đoạn ngắn gần kb gen SSIV Các dịng khuẩn lạc cho kết PCR dƣơng tính đƣợc chọn để nuôi cấy tiến hành tách chiết plasmid, sau cắt kiểm tra enzyme giới hạn EcoRI Hình Kết colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV EcoRI Kết điện di sản phẩm phản ứng cắt cho thấy chọn đƣợc dòng plasmid tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV cho băng DNA kích thƣớc theo tính tốn lý thuyết là: 10661 bp, 2201 bp 1486 bp, chứng tỏ thiết kế thành công vector pK7WG2D/SSIV 3.2.2 Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen thiết kế Vector chuyển gen pK7WG2D/SSIV thiết kế đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến chủng A rhizogenes K599 Sản phẩm trình biến nạp Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 47 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng đƣợc ni mơi trƣờng YMB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l Spectinomycin, ủ 28oC Sau ngày thu đƣợc lƣợng lớn khuẩn lạc đĩa thạch Sau sàng lọc phƣơng pháp colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F SSIV-Frag_R, dòng Agrobacterium mang cấu trúc chuyển gen sau đƣợc ni lỏng ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc 28oC qua đêm, giữ Glycerol ĐCsauMđó đƣợc 20% và7bảo quản tủ -84oC 960 bp Hình Kết điện di colony-PCR dòng khuẩn lạc Kế t quả điê ̣n di s ản phẩm PCR cho thấ y m ột số dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, mang xuất băng PCR kích thƣớc khoảng 960 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyế t của đo ạn gen PCR mồi SSIV-Frag_F SSIV-Frag_R Kế t quả trên, chƣ́ng tỏ các dòng vi khu ẩn đã mang gen cầ n chuyể n Chúng chọn cá c khuẩ n la ̣c có k ết PCR dƣơng tính ni mơi trƣờng LB lỏng và nuôi tạo dịch huyền phù tế bào vi khuẩn để chuyển gen t ạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV 3.3 Kết chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV Thí nghiệm chọn hệ thống nuôi cấy rễ tơ với mục đích đánh giá khả tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột gen SSIV mơ hình khoai lang KB1 Đối với cấu trúc gen SSIV, sử dụng 216 mảnh đoạn thân khoai lang Sau lây nhiễm đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium, mảnh khoai lang đƣợc đặt mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung kanamycin nồng độ cao (30 - 50 mg/L) Do trình xâm nhiễm, cấu trúc gen SSIV, gen SSIV vector chuyển gen mã hóa cho Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 48 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng enzyme phân hủy kanamycin đƣơc tích hợp vào genome thực vật chủ nên mơ lá, thân đƣợc chuyển gen sống sót mơi trƣờng kháng sinh kanamycine cảm ứng tạo rễ ( Hình 10) Hình 10 Hình ảnh mảnh thân mẫu khoai lang in vitro môi trƣờng đồng nuôi cấy sau ngày lây nhiễm A.rhizogenes Hình 11 Hình ảnh mảnh thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu rễ môi trƣờng chọn lọc sau chuyển gen 30 ngày Qua theo dõi, mô đƣợc lây nhiễm với A.rhizogenes mang cấu trúc SSIV có khả biệt hóa tạo rễ tơ môi trƣờng MS bổ sung 30 mg/L kanamycine Quá trình phát sinh kiểu hình rễ tơ diễn sau từ 20 đến 30 ngày sau lây nhiễm Agrobacterium Các mảnh thân chuyển gen có xu hƣớng hình thành rễ cạnh cắt bỏ gân gây tổn thƣơng Các dòng rễ chuyển gen SSIV Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 49 http://www.lrc.tnu.edu.vn ... 46 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D /SSIV kỹ thuật Gateway 46 3.2.2 Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen thiết kế 47 3.3 Kết chuyển gen tạo... trúc gen SSIV, gen SSIV vector chuyển gen mã hóa cho Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 48 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng enzyme phân hủy kanamycin đƣơc tích hợp vào genome... mang gen SSIV 48 3.5 Phân tích dịng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV kỹ thuật PCR 50 3.6 Phân tích chuyển gen SSIV kỹ thuật RT-PCR 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 KẾT