(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - NGUYỄN MẬU HƢNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘThạc GIÁO Luận văn sỹ DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ Mậu Hưng Nguyễn CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420114 Học viện: Hƣớng dẫn khoa học: Nguyễn Mậu Hƣng TS Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2016 LỜI CAM ĐOAN Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn hoàn toàn hoàn thiện quá trình nghiên c ứu khoa học thân hướng dẫn trực tiếp TS Phạm Bích Ngọc v ới cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Các số liệu hình ảnh, kết trình bày, luận văn trung thực, không chép tài liệu, công trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan mình trước hội đồng khoa học Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hƣng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tơi hồn thành luận văn này: TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật Viện Công nghệ Sinh học, hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài PGS.TS Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học bảo tận tình chuyên môn, theo sát thí nghiệm tơi để có lời khuyên bổ ích kịp thời ThS Lê Thu Ngọc, CN Nguyễn Khắc Hưng, CN Phạm Thanh Tùng giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô giáo Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập vừa qua Bằng tình cảm chân thành, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng MỤC LỤC MỞ ĐẦU 11 Đặt vấn đề 11 Mục đích nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 Ý nghĩa khoa học 13 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 Tổng quan tinh bột sinh tổng hợp tinh bột 14 1.1.1 Giới thiệu tinh bột 14 1.1.2 Cấu trúc tinh bột 15 1.1.3 SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT 16 1.1.4 HÌNH DẠNG TINH BỘT 17 1.1.5 Các loại hạt tinh bột hay gặp 17 1.1.6 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột gen liên quan 18 1.1.7 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến trình trao đổi tinh bột 21 1.2 Cây sắn tình hình sản xuất sắn giới Việt Nam 22 1.3 Rễ tơ ứng dụng nuôi cấy rễ tơ sản xuất protein tái tổ hợp 26 1.4 Giới thiệu Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ tế bào thực vật 28 1.5 Cơ chế chuyển gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 29 1.6 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 30 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu , hóa chất thiết bị 32 2.1.1 Thực vật 32 2.1.2 Chủng khuẩn, vector cặp mồi sử dụng 32 2.1.3 Hóa chất 33 2.1.4 Thiết bị 33 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.2 Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV 34 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 34 2.2.2 Phản ứng RT-PCR 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 2.2.3 Tách dòng sản phẩm vector pENTR™/D-TOPO 36 2.2.4 Kiểm tra khuẩn lạc phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc 37 2.2.5 Tách chiết plasmid 38 2.2.6 Xác định trình tự so sánh trình tự gen thu đƣợc với trình tự tƣơng ứng GenBank 39 2.2.7 Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV kỹ thuật Gateway 39 2.2.8 Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 42 2.2.9 Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen môi trƣờng chọn lọc 43 2.2.10 Phƣơng pháp xử lí số liệu 43 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase sắn 44 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 44 3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV sắn tổng hợp cDNA 44 3.1.3 Phân lập, tách dịng, giải trình tự gen SSIV sắn 45 3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tƣơng ứng 46 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV kỹ thuật Gateway 46 3.2.2 Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen thiết kế 47 3.3 Kết chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV 48 3.5 Phân tích dịng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV kỹ thuật PCR 50 3.6 Phân tích chuyển gen SSIV kỹ thuật RT-PCR 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 KẾT LUẬN: 55 ĐỀ NGHỊ: 55 Tài Liệu Tham Khảo 56 Phụ Lục: Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc phân tử amylopectin amylose 15 Hình Quá trình sinh tổng hợp tinh bột enzyme liên quan 19 Hình Cây Sắn 23 Hình Sản lƣợng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not defined Hình Tỷ lệ sản lƣợng sắn nƣớc giới, 2012Error! Bookmark not defined Hìnhaltime PCR hay qRT-PCR) đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ biểu gen quan tâm mô quan khác hay giai đoạn phát triển Đây phƣơng pháp nhanh, nhạy, hiệu để xác định biểu gen trình phát triển đặc thù thực vật Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 31 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu , hóa chất thiết bị 2.1.1 Thực vật Giống sắn KM140 đƣợc thu thập Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm - nông nghiệp Hƣng Lộc, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Mẫu khoai lang KB1 nuôi cấy điều kiện in vitro Phịng Cơng - nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp 2.1.2 Chủng khuẩn, vector cặp mồi sử dụng - Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599, Escherichia coli DH5(α) Phịng cơng nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp - Vector tách dòng pBT để tách dòng đoạn gen SSIV mã hóa cho enzym stacrch synthase IV đƣợc phân lập từ giống sắn KM140, Vector chuyển gen pK7GWIWG2 (II) (Ghent Uni Belgium); vector nhân dịng pENTR TM/DTOPO® Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng Mục đích Nhân đoạn gen Tên Trình tự mồi mồi SSIV_F CACCATGGCGTCGAAGCTATCGA EcoRI CGTGGTTTCTG SSIV_R TTAGACCTACTTGCTGCCGCTCT TG SSIV Chiều dài gen 3,5 kb SSIVCCTCTCCTGAACAACCTCCA Kiểm tra vector Frag_F pK7WG2D/SSIV SSIV- 1kb Frag_R GCAAACTTCCCACCTTTTCC Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 32 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 2.1.3 Hóa chất Dung dịch tách chiết plasmid: Dung dịch (25 nM Tris HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0; 50 mM Glucose); Dung dịch (0,2 M NaOH; 1% SDS); Dung dịch (3M CH3COOK; 11,5% CH3COOH); Isopropanol, Ehtanol 70%; dung dịch Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris, 20mM acetic acid mM EDTA); Agarose 0,8%; Ethidium bromide 0,5 µg/ml, thang ADN 1kb (Thermo); kit tinh ADN Gene JET gel extraction (Thermo) Kit tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) hãng QIAGEN (Đức); Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen, Cat No: 911791 – 020) Các hóa chất đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin, chất điều hòa sinh trƣởng BAP, kinetin, IBA, NAA, Yeast extract, Bacto pepton, Trypton, NaCl, Agarose, Sucrose, Tris HCL, EDTA, MgSO4, Glycerol, Glycine betaine, Proline, Kanamycin, Rifamycin, Cefotaxime, X-gluc loại hóa chất thơng dụng khác đƣợc cung cấp hãng nhƣ Sigma (Mỹ), Merck (Đức) Wako (Nhật Bản) 2.1.4 Thiết bị Các thiết bị dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật chuyển gen: box cấy vơ trùng, bình nuôi cây, dàn nuôi cấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy đo OD Các thiết bị dùng sinh học phân tử: pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh điện di (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Eppendorf), điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR System 9700 (Appied Biosystem), bể ổn nhiệt, máy biến nạp xung điện, máy voltex v.v trang thiết bị khác Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 33 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 Quy trình tách chiết RNA đƣợc thực theo hƣớng dẫn kit PureLink Plant RNA Reagent, Invitrogen Đầu tiên nghiền 0,1 g mẫu nitro lỏng Sau bổ sung 0,5 ml PureLink®Plant RNA Reagent lạnh, đảo Ủ phút nhiệt độ phòng Rồi ly tâm 12000 vòng phút nhiệt độ phòng Chuyển phần dịch qua ống ly tâm Bổ sung 0,1 mL NaCl M, trộn Bổ sung thêm 0,3 mL Chloroform, trộn Ly tâm 12000 vòng 10 phút 4°C, chuyển pha qua ống ly tâm Thêm lần thể tích isopropanol, trộn ủ nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm 12000 vòng 10 phút 4°C, bỏ phần dịch Tiếp tục bổ sung ml cồn 75%, trộn Ly tâm 12000 vòng phút nhiệt độ phòng, bỏ dịch, dùng pipet cẩn thận hút hết dịch ống ly tâm Bổ sung 30 μL nƣớc khử RNase, trộn đều, mẫu đƣợc bảo quản -80°C 2.2.2 Phản ứng RT-PCR - - Sử dụng 500 ng RNA tổng số để tổng hợp cDNA Thành phần Thể tích RNA tổng số 500 ng Mồi ngẫu nhiên (Hexam) 1µL Nƣớc khử ion Dẫn đến 12µl Trộn nhẹ, ủ 65°C phút Cắm vào đá, sau bổ sung thành phần Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 34 http://www.lrc.tnu.edu.vn ... THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420114 Học viện:... sắn KM140, trình tự gen SSIV đƣợc đăng ký Ngân hàng Genebank:KT033500 - Đã thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen SSIV mã hoá enzyme tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột tạo chủng vi khuẩn... trúc gen SSIV, gen SSIV vector chuyển gen mã hóa cho Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 48 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng enzyme phân hủy kanamycin đƣơc tích hợp vào genome