Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420114 Học viện: Hướng dẫn khoa học: Nguyễn Mậu Hưng TS Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2016 LỜI CAM ĐOAN Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn hoàn toàn hoàn thiện qua trình nghiên c ứu khoa học thân hướng dẫn trực tiếp TS Phạm Bích Ngọc v ới cán Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Các số liệu hin ̀ h ảnh, kết trin ̀ h bày, luận văn trung thực, không chép tài liệu, công trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan mình trước hội đồng khoa hoc Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tơi hồn thành luận văn này: TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Cơng nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trin ̀ h thực đề tài PGS.TS Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học bảo tận tình chuyên môn, theo sát thi nghiệm tơi để có lời khuyên bổ ích kịp thời ThS Lê Thu Ngọc, CN Nguyễn Khắc Hưng, CN Phạm Thanh Tùng giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô giáo Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập vừa qua Bằng tin ̀ h cảm chân thành, xin gửi lời cảm ơn đến gia đin ̀ h bạn bè bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng MỤC LỤC MỞ ĐẦU 11 Đặt vấn đề 11 Mục đích nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 Ý nghĩa khoa học 13 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 Tổng quan tinh bột sinh tổng hợp tnh bột 14 1.1.1 Giới thiệu tnh bột 14 1.1.2 Cấu trúc tinh bột 15 1.1.3 SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT 16 1.1.4 HÌNH DẠNG TINH BỘT 17 1.1.5 Các loại hạt tinh bột hay gặp 17 1.1.6 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột gen liên quan 18 1.1.7 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến trình trao đổi tnh bột 21 1.2 Cây sắn tnh hình sản xuất sắn giới Việt Nam 22 1.3 Rễ tơ ứng dụng nuôi cấy rễ tơ sản xuất protein tái tổ hợp 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐHTN Luận văn Thạc sỹ 1.4 Nguyễn Mậu Hưng Giới thiệu Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ tế bào thực vật 28 1.5 Cơ chế chuyển gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 29 1.6 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu , hóa chất thiết bị 32 2.1.1 Thực vật 32 2.1.2 Chủng khuẩn, vector cặp mồi sử dụng 32 2.1.3 Hóa chất 33 2.1.4 Thiết bị 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2 Phương pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV 34 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 34 2.2.2 Phản ứng RT-PCR 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 2.2.3 Tách dòng sản phẩm vector pENTR™/D-TOPO 36 2.2.4 Kiểm tra khuẩn lạc phương pháp PCR từ khuẩn lạc 37 2.2.5 Tách chiết plasmid 38 2.2.6 Xác định trình tự so sánh trình tự gen thu với trình tự tương ứng GenBank 39 2.2.7 Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV kỹ thuật Gateway 39 2.2.8 Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 42 2.2.9 Phương pháp đánh giá mô chuyển gen môi trường chọn lọc 43 2.2.10 Phương pháp xử lí số liệu 43 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase sắn 44 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 44 3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV sắn tổng hợp cDNA 44 3.1.3 Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV sắn 45 3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tương ứng 46 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV kỹ thuật Gateway 46 3.2.2 Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen thiết kế 47 3.3 Kết chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐHTN Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 3.5 Phân tích dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV kỹ thuật PCR 50 3.6 Phân tích chuyển gen SSIV kỹ thuật RT-PCR 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 KẾT LUẬN: 55 ĐỀ NGHỊ: 55 Tài Liệu Tham Khảo 56 Phụ Lục: Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc phân tử amylopectin amylose 15 Hình Quá trình sinh tổng hợp tinh bột enzyme liên quan 19 Hình Cây Sắn 23 Hình Sản lượng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not defined Hình Tỷ lệ sản lượng sắn nước giới, 2012Error! Bookmark not defined Hình Vector pK7GWG2D 40 Hình RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140 .44 Hình Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn45 Hình Colony-PCR chọn lọc dòng khuẩn mang vector pENTR/SSIV 46 Hình 10 Kết colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV EcoRI .47 Hình 11 Kết điện di colony-PCR dòng khuẩn lạc 48 Hình 12 Hình ảnh mảnh thân mẫu khoai lang in vitro môi trường đồng nuôi cấy sau ngày lây nhiễm A.rhizogenes 49 Hình 13 Hình ảnh mảnh thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu rễ môi trường chọn lọc sau chuyển gen 30 ngày 49 Hình 14 Kết tách chiết DNA tổng số số rễ tơ 50 Hình 15 Sản phẩm PCR nhân gen SSIV từ DNA tổng số tách chiết từ số dòng rễ tơ chuyển gen không chuyển gen 51 Hình 16 Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động gen actin dòng rễ tơ chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; - 15: sản phẩm RT-PCR chuyển gen .52 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng Hình 17 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động gen 52 DANH MỤC BẢNG Bảng Diện tích, suất sản lượng sắn giới từ năm 2000-2012 Error! Bookmark not defined Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng 32 Bảng Kích thước phân đoạn thu cắt plasmid tái tổ hợp pK7GWG2D/SSIV EcoRI 41 Bảng 4: Kết chuyển gen tạo rễ tơ mang cấu trúc gen tăng cường tổng hợp tinh bột SSIV khoai lang 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn K R F S F H H P G K F F W R G Q F Y G E H D D F MeSSiv sequencing K R F S F 2090 2100 H H P G K F F W R G Q F Y G E H D D F 2040 2050 2060 2070 2080 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TTTCAGCCGTGCTGCACTTGAATTGCTTCTTCAAGCTGGCAAAAAACCAGACATAATTCATTGCCATGA C I H C H D F S R A A L E L L L Q A G K K P D I MeSSiv sequencing I H C H D 2160 2170 F S R A A L E L L L Q A G K K P D I 2110 2120 2130 2140 2150 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TGGCAGACAGCTTTTGTTGCACCACTTTATTGGGATATATACGCCCCAAAAGGATTGAATTCAGCTAGA A L N S A R W Q T A F V A P L Y W D I Y A P K G MeSSiv sequencing L N S A R W Q T A F V A P L Y W D I Y A P K G 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TATGTTTTACCTGTCACAACTTTGAGTACCAGGGGAGTGCACCAGCATCAGAATTGGCATCTTGTGGAC T Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 13 http://www.lrc.tnu.edu.vn A S C G L I C F T C H N F E Y Q G S A P A S E L MeSSiv sequencing A S C G L 2300 2310 I C F T C H N F E Y Q G S A P A S E L 2250 2260 2270 2280 2290 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TGATGTCCAGCAGCTAAACAGACCAGATAGAATGCAGGACAACTCAGCACATGATAGGATCAATCCTA TT D V Q Q L N R P D R M Q D N S A H D R I N P I MeSSiv sequencing D V Q Q L N R P D R M Q D N S A H D R I N P I 2370 2380 2320 2330 2340 2350 2360 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin AAGGGTGCAGTGGTGTTCTCAAACATTGTGACAACAGTATCACCCACCTATGCACAAGAAGTGCGGAC TT Q E V R T MeSSiv K G A V V F S N I V T T V S P T Y A sequencing Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 14 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 14 Nguyễn Mậu Hưng http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc Q sỹ E V R T 2440 2450 K G A V V F S N I V T T V S P T Y ANguyễn Mậu Hưng 2390 2400 2410 2420 2430 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin CTGAGGGCGGAAAAGGTCTCCATTCGACGCTTAACTTTCATGCCAAGAAGTTCATTGGAATCCTAAAT GG G I L N G S E G G K G L H S T L N F H A K K F I MeSSiv sequencing G I L N G 2510 2520 S E G G K G L H S T L N F H A K K F I 2460 2470 2480 2490 2500 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TATTGATACTGATGTGTGGAATCCTGCGACTGATACTCTTCTCGAAGTCCAGTACAATGCTAACGATCTT N A N D L I D T D V W N P A T D T L L E V Q Y MeSSiv sequencing N A N D L 2580 2590 I D T D V W N P A T D T L L E V Q Y 2530 2540 2550 2560 2570 | | | | | | | | | | | | | | Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 15 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ MeSSiv-origin Nguyễn Mậu Hưng CAAGGAAAAGCAGAAAACAAAATAGCTACAAGGCAGCATCTTGGGTTATCAACTGCAGATGCTAGGC AGC Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 15 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc A sỹ D A R Q Q G K A E N K I A T R Q H L G L S TNguyễn Mậu Hưng MeSSiv sequencing A D A R Q 2650 2660 Q G K A E N K I A T R Q H L G L S T 2600 2610 2620 2630 2640 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin CACTGGTTGGCTGCATAACAAGATTGGTGCCACAGAAAGGTGTACATCTTATTAGACATGCAATATACC G H A I Y R P L V G C I T R L V P Q K G V H L I R MeSSiv sequencing H A I Y R 2720 2730 P L V G C I T R L V P Q K G V H L I R 2670 2680 2690 2700 2710 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TACGCTGGAGTTGGGAGGACAATTTCTACTTCTTGGCTCAAGCCCAGTTGCACATATACAGAGGGAAT TT I Q R E F T L E L G G Q F L L L G S S P V A H MeSSiv sequencing T L E L G G Q F L L L G S S P V A H I Q R E F Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 16 http://www.lrc.tnu.edu.vn 2790 2800 2740 2750 2760 2770 2780 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin GAGGGTATTGCAAATCACTTTCAGAATCATGAGCACATTCGGCTGGTATTGAAGTATGATGAATCTCTC G Y D E S L E G I A N H F Q N H E H I R L V L K MeSSiv sequencing Y D E S L 2860 2870 E G I A N H F Q N H E H I R L V L K 2810 2820 2830 2840 2850 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin CTCATTCCATTTATGCAGCATCTGACATGTTCATCATCCCATCTATCTTTGAGCCTTGTGGCCTTACACA C G L T Q A H S I Y A A S D M F I I P S I F E P MeSSiv sequencing C G L T Q 2930 2940 A H S I Y A A S D M F I I P S I F E P 2880 2890 2900 2910 2920 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin GATGATAGCAATGAGATATGGTTCCATACCCATTGCAAGAAAAACCGGTGGTCTAAATGATAGTGTTTT T M I A M R Y G S I P I A R K T G G L N D S V F MeSSiv sequencing .G N D S V L 3000 3010 M I A M R Y G S I P I A R K T G G L 2950 2960 2970 2980 2990 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin GATGTTGATGATGACACAATTCCTCTTCAGTTTCGAAATGGATATACATTCTTGAATCCTGATGAGCAGG N P D E Q D V D D D T I P L Q F R N G Y T F L MeSSiv sequencing N P D E Q 3070 3080 D V D D D T I P L Q F R N G Y T F L 3020 3030 3040 3050 3060 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin GAGTGAATAGTGCTTTAGAACGTGCATTTAACCATTATAGAAACGATCCTGAGAGCTGGCAGCAGCTT GT W Q Q L V G V N S A L E R A F N H Y R N D P E S MeSSiv sequencing G W Q Q L V G V N S A L E R A F N H Y R N D P E S 3090 3140 3150 3100 3110 3120 3130 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TCAAAGGGACATGGACATAGATTTTAGTTGGGAATCTTCAGCATCACAGTATGAGGAGCTCTACTCAA AA L Y S K Q R D M D I D F S W E S S A S Q Y E E MeSSiv sequencing .A .A L Y S K 3210 Q K D M N I D F S W E S S A S Q Y E E 3160 3220 3170 3180 3190 3200 | | | | | | | | | | | | | | MeSSiv-origin TCAGTGGCCAGAGCAAGAGCGGCAGCAAGTAGGTCTTAATTATGGTAAATGGCATTTTCATGGAAAGC CA S V A R A R A A A S R S * MeSSiv sequencing S V A R A R A A A S R S * | MeSSiv-origin AGGATCT MeSSiv sequencing So sánh trình tự gen SSIV phân lập với gen SSIV phytozome Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 19 http://www.lrc.tnu.edu.vn ... SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT... mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột Mục đích nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase, đồng... động gen Starch Synthase IV Đây gen định lớn đến sinh tổng hợp cấu trúc tnh bột Để có Starch Synthase IV đánh giá gen ti ến hành: Nghiên cứu phân lập thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme