Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương

Nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hưởng chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng điều trị vết thương Đoàn Hoàng Thu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số 60 42 01 14 Người hướng dẫn: TS BS Đinh Văn Hân; PGS TS Ngô Giang Liên Năm bảo vệ: 2014 Keywords Sinh học thực nghiệm; Sinh học; Tế bào; Tế bào da; Điều trị vết thương; Tế bào gốc mỡ Content ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc lĩnh vực sinh học lôi Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc y học giới lựa chọn liệu pháp hữu hiệu để chữa khỏi số bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy, xương khớp…Trên giới, có số nguồn tế bào gốc đưa vào ứng dụng tế bào gốc tủy xương tế bào gốc máu cuống rốn, tế bào gốc từ nguồn chủ yếu tế bào gốc tạo máu nên ứng dụng nghiên cứu điều trị bệnh máu, bệnh cần có tái tạo thuộc hệ thống trung mô ứng dụng Trong đó, bệnh trung mô lại thường gặp vết thương, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim…Một nguồn TB gốc khác kỳ vọng nhiều tế bào gốc phôi, có tiềm lớn việc nghiên cứu sử dụng khó khăn công nghệ đặc biệt bị cản trở vấn đề y đức (sử dụng tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc hủy phôi vốn trở thành người) Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác tế bào gốc từ phần phụ thai bánh rau, dây rốn Thành công công nghệ tách nhân lên tế bào gốc có bệnh nhân có bảo quản dây rốn – bánh rau…khi sinh có hy vọng dùng nguồn tế bào gốc Hiện nay, có số lượng người lưu giữ dây rốn hay bánh rau sau sinh ra, đồng thời chi phí tốn xác suất người lưu trữ mô lại có bệnh cần điều trị tế bào gốc cao Tế bào gốc mỡ quần thể tế bào vạn năng, chúng biệt hóa thành nhiều dòng khác Mô mỡ loại mô có sẵn với số lượng lớn dễ dàng thu hồi nên nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo tương lai sử dụng để ghép tự thân đặc biệt không gặp phải vấn đề y đức Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ dạng tế bào quan trọng di cư đến vùng tổn thương để thực nhiều khâu pha tăng sinh trình liền vết thương Tế bào gốc trung mô nghiên cứu tách từ mô mỡ thành phần tế bào tách nhiều dạng tế bào khác bạch cầu, hồng cầu…Tỷ lệ tế bào gốc trung mô thay đổi nên khó xác định xác cần sử dụng tế bào cần thiết tế bào hỗn dịch tế bào tách đủ lần ghép điều trị vết thương Do đó, cần nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình tách tinh lọc tế bào gốc trung mô Nếu tế bào gốc trung mô tách lại có tác dụng kích thích tăng sinh di cư loại tế bào chủ yếu da sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ lâm sàng định hướng cho nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học phục vụ điều trị tổn thương thuộc hệ thống trung mô đặc biệt vết thương vết bỏng Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thương ghép tế bào gốc lớn, cụ thể Mỹ với 260 triệu dân hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang vết thương mạn tính Hàng năm miền tây Châu Âu có khoảng 150.000 người cần điều trị da nhân tạo Riêng Đức có khoảng triệu người bị loét chi phí lên tới tỷ Euro dành cho điều trị Tại Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn bỏng [8] Tuy chưa có số thống kê cụ thể tính riêng Viện Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị nhu cầu ghép da chiếm khoảng 2500 bệnh nhân Xuất phát từ sở khoa học tiềm ứng dụng tế bào gốc mỡ, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hưởng chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau: Đánh giá đặc điểm phân lập tăng sinh tế bào gốc mỡ điều kiện nuôi cấy invitro Đánh giá ảnh hưởng tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy Reference TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Trịnh Bình, Phạm Phan Địch, Đỗ Kính (2002), Mô học, Nhà xuất y học, Hà Nội Phùng Quốc Đại, Phạm Mạnh Hùng (1997), ―Sự thay đổi globulin miễn dịch bệnh nhân bỏng‖, Thông tin bỏng, 2, tr 27-28 Trần Văn Hanh (1997), ―Quan điểm mô học đại trình liền vết thương‖, Tài liệu đào tạo sau đại học – chuyên đề mô học, Đại học Y Hà Nội, tr 141-156 Đinh Văn Hân, Nguyễn Thị Hương (2014), ―Nghiên cứu chế tạo hỗn dịch tế bào da tự thân không qua nuôi cấy dể điều trị vết thương vết bỏng‖, Tạp chí y học thảm học & Bỏng, 3, tr 40 - 48 Đinh Văn Hân, Trần Ngọc Diệp, Nguyễn Tiến Dũng (2013) ―Đánh giá tác dụng dung dịch chiết nguyên bào sợi da nuôi cấy điều trị vết thương mạn tính‖, Tạp chí y học thảm hoạ & Bỏng, 2, tr 47 – 54 Nguyễn Văn Huệ, Đinh Văn Hân CS (2006), Hợp tác nghiên cứu áp dụng công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi điều trị vết thương vết bỏng, Đề tài cấp nhà nước Nghị định thư hợp tác với Liên Bang Nga Nguyễn Văn Huệ, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Hải An (2000), ―Nhận xét giảm bạch cầu máu ngoại vi trẻ em bỏng nặng‖, Tạp chí thông tin y dược, 10, tr 92-96 Nguyễn Viết Lượng (2009), ―Tình hình bỏng Việt Nam năm 2005 -2007‖, Tạp chí y học thảm hoạ & bỏng, 1, tr 26 Phạm Quang Ngọc (1990), ―Màng ối đông khô diệt khuẩn tia gama dùng làm băng sinh học để điều trị vết bỏng‖, Tạp chí Y học thực hành, (2)285, tr 23 10 Phạm Đình Phú (1994), ―Ghép da đồng loại lần góp phần cứu sống bệnh nhân bỏng sâu diện rộng‖, Thông tin bỏng, 2, tr 17 11 Nguyễn Hữu Phùng, Dương Ngọc (1994), ―Sử dụng da ếch màng ối đông khô điều trị bỏng nặng‖, Thông tin bỏng, 2, tr 15-16 12 Đỗ Quang, Đỗ Quang Hùng (1995), ―Sử dụng lâm sàng màng ối đơn người làm băng sinh học chữa bỏng bệnh da‖, Thông tin bỏng, 1, tr 16-18 13 Lê Thế Trung (2003), Bỏng kiến thức chuyên ngành, NXB Y Học 14 Trần Ngọc Tuấn, Đặng Tất Hùng (1996), ―Ứng dụng ghép da mắt lưới kết hợp da tự thân với da dị loại bệnh nhân bỏng sâu diện rộng‖, Thông tin bỏng, 3, tr 17-20 B Tiếng Anh 15 Akino K, Mineda T, Akita S (2005), ―Early cellular changes of human mesenchymal stem cells and their interaction with other cells‖, Wound Repair Regen, 13, pp 434– 440 16 Altman AM, Yan Y, Matthias N, et al (2008) IFATS Series: ―human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model‖, Stem Cells 17 Alvarez-Diaz C, Cuenca-Pardo J, Sossa-Serrano A (2000), ―Burns treated with frozen cultured human allogeneic epidermal sheets‖, J Burn Care Rehabil, 21, pp 291–299 18 Armour A, Scott P.G, Tredget E.E, (2007), ―Cellular and molecular pathology of HTS: basis for treatment, Wound Repair Regen, 15 (Suppl 1), S6–S17 19 Ayyappan T, Chadha A, Shaikh MF et al (2004) ―Topically applied autologous bone marrow in healing of chronic non-healing raw areas-a pilot study‖, Indian J Burns 2004, 12, pp 42-7 20 Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko M.S, Brem H, Tomic-Canic M (2008), ―Growth factors and cytokines in wound healing‖, Wound Repair Regen, 16, pp 585–601 21 Brem H, Golinko MS, Stojadinovic O et al (2008), ―Primary cultured fibroblasts derived from patients with chronic wounds: a methodology to produce human cell lines and test putative growth factor therapy such as GMCSF‖, Journal of Translational Medicine 75(6) 22 Chen L, Tredget E.E, Wu P.Y, Wu Y (2008), ―Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing‖, PLoS ONE 3, e1886 23 Clark Richard A.F (1993), ―Basic of cutaneous wound repaire‖, J Dermatol surg Oncol, 19(12), pp 116-122 24 Cohen I.K, Diegelman R.F, Crossland M.C, (1994), Wound care and wound healing, Sprnciples of Surgery, 1, pp 279-304 25 Diegelmann R.F, Evans M.C (2004), ―Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing‖, Front Biosci, 9, pp 283–289 26 Falanga V, Iwamoto S, Chartier M, Yufit T, Butmarc J, Kouttab N, Shrayer D, Carson P (2007), ―Autologous bone marrow-derived cultured mesenchymal stem cells delivered in a fibrin spray cceleratehealing in murine and human cutaneous wounds, Tissue Eng‖, 13, pp 1299–1312 27 Falkenberg F.W, Weichert M, Krane H, Bartels I, Palme M, Nagels H.O, Fiebig H (1995), ―In vitro production of monoclonal antibodies in high concentration in a new and easy to handle modular minifermenter‖, J Immunol Meth, 179, pp 13–29 28 Fitzpatrick RE, Rostan EF (2003), ―Reversal of photodamage with topical growth factors: a pilot study‖, J Cosmet Laser Ther, 5, pp 25—34 29 Flynn LE, Prestwich GD, Semple JL, et al (2007) ―Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adiposederived stem cells‖, Biomaterials 2007, (28), pp 34-42 30 Flynn LE, Prestwich GD, Semple JL, et al (4/2008) ―Proliferation and differentiation of adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds‖, Biomaterials, (29), pp 1862-71 31 Friedenstein A.J, Chailakhyan R.K, Latsinik N.V, Panasyuk A.F (1974) ―KeilissBorok, Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues Cloning in vitro and retransplantation in vivo‖, Transplantation, 17, pp 331–340 32 Han S.K, Yoon T.H, Lee D.G et al (2005) ―Potential of human bone marrow stromal cells to accelerate wound healing in vitro‖, Ann Plast Surg 2005, 55, pp 41-49 33 Hansbrough JF, Mozingo DW, Kealey GP, Davis M, Gidner A, Gentzkow GD (1997), ―Clinical trials of a biosynthetic temporary skin replacement, Dermagraft- Transitional Covering, compared with cryopreserved human cadaver skin for temporary coverage of excised burn wounds", J Burn Care Rehabi 1997 Jan-Feb, 18 (1 Pt1), pp 43-51 34 Hehenberger K, Kratz G, Hansson A, Brismar K (1998), ―Fibroblasts derived from human chronic diabetic wounds have a decreased proliferation rate, which is recovered by the addition of heparin‖, J Dermatol Sci, 16, pp 144–151 35 Herndon D.N, Barrow R.E, Rutan R.L, Rutan T.C, Desai M.H, Abston S (1989), ―A comparison of conservative versus early excision Therapies in severely burned patients‖, Ann Surg, 209, pp 547–5528 discussion 552–543 36 Hu R, Ling W, Xu W, Han D (2014), ―Fibroblast-Like Cells Differentiated from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells for Vocal Fold Wound Healing‖, PLoS ONE 9(3): e92676 37 Humpert PM, Bastsch U et al (2005), ―Locally applied mononuclesr bone marrow cells restore angiogenesis and promote wound healing in a type fiabetic patient‖, Exp Clin Endocrinol Diabetes 2005, 113, pp 538-40 38 Hunt T.K (1990), ―Basic principles of wound healing‖, J Trauma ,30(12), pp 122128 39 Hyoju Kim, Kyuseok Choi, Oh-Kyeong Kweon, Wan Hee Kim (2012), ―Enhanced wound healing effect of canine adipose-derived mesenchymal stem cells with low-level laser therapy in athymic mice‖, Journal of Dermatological Science, 68, pp 149–156 40 John F Hasbrough, Hans Oliver Rennekampff (1998), ―Cultured skin cell for wound closure and for promoting wound healing Growth factor and wound healing basic science and potential clinical application‖, Serono Symposia USA Norwell, Massachusetts, pp 37-55 41 Jurgens WJ, Oedayrajsingh-Varma MJ, Helder MN, et al (6/2008), ―Effect of tissueharvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cellbased therapies‖, Cell Tissue Res, (26), pp 332:415 42 Khachemoune A, Bello Y.M, Phillips T.J (2002), ―Factors that influence healing in chronic venous ulcers treated with cryopreserved human epidermal cultures‖, Dermatol Surg, 28, pp 274–280 43 Kim W.S, Lee JJ, Jung DY, Jeon J, Heo HS, Kang HC, et al (2006), ―Profiling of differentially expressed genes in human stem cells by cDNA microarray‖, Mol Cells, 21, pp 343—55 44 Kiristy CP, Lynch AB, Lynch SE (1993), ―Role of growth factors in cutaneuos wound healing: a review‖, Crit Rev Oral Bio Med, 4, pp 729-760 45 Lauffenburger D.A, Horwitz A.F (1996), ―Cell migration: a physically integrated molecular process‖, Cell, 84, pp 359–369 46 Lerman O.Z, Galiano R.D, Armour M, Levine J.P, Gurtner G.C (2003), ―Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast: impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia‖, Am J Pathol, 162, pp 303–312 47 Li Y, Fan J, Chen M, Li W, Woodley D.T (2006), ―Transforming growth factor-alpha: a major human serum factor that promotes human keratinocyte migration‖, J Invest Dermatol, 126, pp 2096–2105 48 Loots M.A, Lamme E.N, Mekkes J.R, Bos J.D, Middelkoop E (1999), ―Cultured fibroblasts from chronic diabetic wounds on the lower extremity (non-insulindependent diabetes mellitus) show disturbed proliferation‖, Arch Dermatol Res, 291, pp 93–99 49 Lu F, Gao JH, Ogawa R, et al (2006 Dec), ―Adipose tissues differentiated by adiposederived stem cells harvested from transgenic mice‖, Chin J Traumatol, 9, pp 359-64 50 MacNeil S (2007), ―Progress and opportunities for tissue-engineered skin‖, Nature 445, pp 874–880 51 Martin M.J et al (2005), ―Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid‖, Nat Med, 11(2), pp 228-32 52 Masakazu Ishii, Chika Koike et al (2005), ―Molecular markers distinguish bone marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts‖, Biochemical and Biophysical Research Communications, 332, pp 297–303 53 McFarlin K, Gao X, Liu Y.B, Dulchavsky D.S, Kwon D, Arbab A.S, Bansal M, Li Y, Chopp M, Dulchavsky S.A, Gautam S.C (2006), ―Bone marrow-derived mesenchymal stem cells accelerate wound healing in the rat‖, Wound Repair Regen, 14, pp 471–478 54 Midwood K.S, Williams L.V, Schwarzbauer J.E (2004), ―Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix‖, Int J Biochem Cell Biol, 36, pp 1031–1037 55 Papini R (2004), ―Management of burn injuries of various depths‖, BMJ 329, pp 158– 160 56 Pereira R.F, Halford K.W, O‘Hara M.D, Leeper D.B, Sokolov B.P, Pollard M.D, Bagasra O, Prockop D.J (1995), ―Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice‖, Proc Natl Acad Sci USA, 92, pp 4857–4861 57 Phan TT, et al (2005), ―Evaluation of cell culture on the polyurethane-based membrane (Tegaderm): implication for tissue engineering of skin‖, Cell Tissue Bank, 6(2), pp 917 58 Phinney D.G, Prockop D.J (2007), ―Mesenchymal stem/multipotent stromal cells; the state of transdifferentiation and modes of tissue repair — current views‖, Stem Cells, 25, pp 2896–2902 59 Ponec M (2002), ―Skin constructs for replacement of skin tissues for in vitro testing‖, Adv.Drug Deliv Rev, 54 (Suppl 1), S19–S30 60 Postlethwaite A.E, Keski-Oja J, Moses H.L, Kang A.H (1987), ―Stimulation of the chemotactic migration of human fibroblasts by transforming growth factor beta‖, J Exp Med, 165, pp 251–256 61 Purdue G.F, et al (1997), ―A Multi-center Clinical Trial of a Biosynthetic Skin Replacement, Dermagraft-TC, Compared with Cryopreserved Human Cadaver Skin for Temporary Coverage of Excised Burn Wounds‖, Journal of Burn Care and Rehabilitation, 18(1), 52-57 62 Reckhenrich A.K, Kirsch B.M, Wahl E.A, Schenck T.L, Rezaeian F, et al (2014), ―Surgical Sutures Filled with Adipose-Derived Stem Cells Promote Wound Healing‖, PLoS ONE 9(3): e91169 63 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, et al (2004) ―Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells‖, Circulation, 109, 1292—8 64 Rubin JP, Bennett JM, Doctor JS, et al (2007 Aug), Plast Reconstr Surg, 120:414-24 65 Sasaki M, Abe R, Fuita Y, Ando S, Inokuma D, Shimizu H (2008), ―Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type‖, J Immunol, 180, pp 2581–2587 66 Schade R, Pfister C, Halatsch R, Henklein P (1991), ―Polyclonal IgY Antibodies from Chicken Egg Yolk—An Alternative to the Production of Mammalian IgG type Antibodies in Rabbits‖, Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments, ATLA, Nottingham, pp 403–419 67 Schaffer CJ, Narrey LB (1996), ―Cell biology of wound healing‖, Int Rev Cytol, 169, pp 151-181 68 Seibold J.R, Uitto J, Dorwart B.B, Prockop D.J (1985), ―Collagen synthesis and collagenase activity in dermal fibroblasts from patients with diabetes and digital sclerosis‖, J Lab Clin Med, 105, pp 664–667 69 Sheng-Ping Huang, Chun-Hsiang Huang, Jia-Fwu Shyu, Herng-Sheng Lee4, Shyi-Gen Chen, James Yi-Hsin Chan and Shih-Ming Huang (2013), ―Promotion of wound healing using adipose-derived stem cells in radiation ulcer of a rat model‖, Journal of Biomedical Science, pp 20-51 70 Sheridan R.L, Tompkins R.G (1999), ―Skin substitutes in burns‖, Burns 25, pp 97103 71 Smith A.N, Willis E, Chan V.T, Muffley L.A, Isik F.F, Gibran N.S, Hocking A.M (2010), ―Mesenchymal stem cells induce dermal fibroblast responses to injury‖, Exp Cell Res, 316, pp 48–54 72 Supp D.M, Boyce S.T (2005), ―Engineered skin substitutes: practices and potentials‖, Clin Dermatol, 23, pp 403–412 73 Togel F, Weiss K, Yang Y, Hu Z, Zhang P, Westenfelder C (2007), ―Vasculotropic, paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury‖, Am J Physiol Renal Physiol , (292), F1626–F1635 74 Vacanti C.A, Mikos A.G (1995), Tissue Eng, 1, pp 1–2 75 Valbonesi M, Giannini G, et al (2004), ―Cord blood (CB) stem cells for wound repaire‖, Transfus Apher Sci 2004, 30:153-6 76 Wahl LM, Wahl SM (1992), Inflamation In: Cohen IK, Diegelmann RF, Lindblad WJ, et all Wound Healing Biochemical and Clinical Aspects, Philadelphia, PA: WB Saunders Company, pp 40-60 77 Wainwright D.J (1995), ―Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns‖, Burns, 21, pp 243–248 78 Wall S.J, Sampson M.J, Levell N, Murphy G (2003), ―Elevated matrix metalloproteinase-2 and -3 production from human diabetic dermal fibroblasts‖, Br J Dermatol, 149, pp 13–16 79 Werner S, Richard G (2003), ―Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines‖, Physiol Re, 83, pp 835-870 80 Woodley D.T, Peterson H.D, Herzog S.R, Stricklin G.P, Burgeson R.E, Briggaman R.A, Cronce D.J, O'Keefe E.J (1988), ―Burnwounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils‖, JAMA, 259, pp 2566– 2571 81 Won-Serk Kim, Byung-Soon Park, Jong-Hyuk Sung, Jun-Mo Yang, Seok-Beom Park, Sahng-June Kwak, Jeong-Soo Park (2007), ―Wound healing effect of adipose-derived stem cells: A critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts‖ Journal of Dermatological Science, 48, pp 15—24 82 Wu Y, Chen L, Scott P.G, Tredget E.E (2007), ―Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis‖, Stem Cells, 25, pp 2648– 2659 83 Zhang YS, Gao JH, Lu F, et al (2007 Feb), ‗‗Cellular compatibility of type collagen I scaffold and human adipose-derived stem cells‖, Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 27:223-5 84 Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, et al (2002), ―Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells‖, Mol Biol Cell, 13:4279—95 85 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, et al (2001), ―Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies‖, Tissue Eng, 7:211—28 [...]... 25, pp 2648– 2659 83 Zhang YS, Gao JH, Lu F, et al (2007 Feb), ‗‗Cellular compatibility of type collagen I scaffold and human adipose-derived stem cells‖, Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 27:223-5 84 Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, et al (2002), ―Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells‖, Mol Biol Cell, 13:4279—95 85 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell