Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương

Luận văn gồm các mục tiêu sau: Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều kiện nuôi cấy invitro; đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ĐỒN HỒNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO  GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ  BÀO DA NI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU  TRỊ VẾT THƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ĐỒN HỒNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ  BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN  TẾ BÀO DA NI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG  ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG Chun ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số              : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Đinh Văn Hân PGS. TS. Ngơ Giang Liên Hà Nội ­ 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới Tiến   sĩ Đinh Văn Hân và PGS. TS. Ngơ Giang Liên – những người thầy đã tận tâm,   nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn cũng như động viên, cổ  vũ tinh thần cho em trong   suốt q trình thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ Em xin bày tỏ  lời cảm  ơn sâu sắc đến những thầy cơ giáo đã giảng dạy   em trong những năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường   sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai.  Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh   học, Bộ  mơn Sinh học Tế  bào ­ Trường Đại học Khoa học Tự  nhiên – Đại học   Quốc gia Hà Nội  đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa học Xin chân thành cảm  ơn các cơ chú, anh chị  và các bạn đồng nghiệp tại   Khoa Labo nghiên cứu  ứng dụng trong điều trị  Bỏng – Viện Bỏng Quốc Gia đã   quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực hiện đề tài Cuối cùng, xin được gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả  những   người thân u đã ln động viên, khích lệ, giúp đỡ  em trong q trình học tập   để em hồn thành bản luận văn này!   Hà Nội, ngày 16 tháng 08 năm 2014 Học viên                                                                Đồn Hồng Thu MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Khả năng tạo dòng của tế bào mới tách ra từ mơ mỡ (n=5)                Error:      Reference source not found Bảng 2. Khả năng tạo CFU­F theo các thế hệ tế bào (n=5)             Error: Reference      source not found Bảng 3. Ảnh hưởng của tế bào gốc đến tăng sinh nguyên bào sợi  Error: Reference  source not found Bảng 4. Thời điểm nguyên bào sợi gia tăng số lượng khi có tấm tế bào gốc          Error:      Reference source not found Bảng 5. Tỷ lệ sống của nguyên bào sợi sau khi trypsin.  Error: Reference source not  found Bảng 6. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc đến tăng sinh tế bào sừng                  Error:      Reference source not found Bảng 7. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc tới di cư tế bào sừng         Error: Reference      source not found DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau của   quá trình liền vết thương                                        Error: Reference source not found      Hình 2. Mơ phỏng thí nghiệm đánh giá  ảnh hưởng của tế bào gốc mơ mỡ  bằng   phương pháp đồng ni cấy                                    Error: Reference source not found      Hình 3. Tạo vết thương in vitro                               Error: Reference source not found      Hình 4. Tách mơ mỡ bằng enzym collagenase        Error: Reference source not found      Hình 5. Đĩa tế bào sau 48h ni cấy.                     Error: Reference source not found      Hình 6. Tế bào sau 4 và 10 ngày ni cấy              Error: Reference source not found      Hình 7. Tế bào gốc mỡ trên kính hiển vi đảo ngược 50X(A) và 100X(B)          Error:      Reference source not found Hình 8. Hình thái tế bào gốc mỡ sau khi nhuộm Giemsa. (100X)       Error: Reference     source not found Hình 9. Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ 1 và 5. (50X) Error: Reference source  not found Hình 10. Tế bào gốc mỡ tạo colony ở ngày thứ 10 và 20. (50X)       Error: Reference      source not found Hình 11. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa       Error: Reference source not found      Hình 12. Biểu đồ  so sánh số  lượng tế  bào thu được giữa các thí nghiệm đồng   ni cấy tấm tế bào gốc mơ mỡ với ngun bào sợi ở ngày thứ 2  Error: Reference  source not found Hình 13. Tác động của tấm tế bào gốc mơ mỡ  lên sự  tăng sinh của ngun bào   sợi (50X)                                                                   Error: Reference source not found      Hình 14. Sự gia tăng số lượng nguyên bào sợi theo thời gian          Error: Reference      source not found Hình 15. So sánh số  lượng tế  bào thu được giữa các thí nghiệm đồng ni cấy   tấm tế bào gốc với tế bào sừng                              Error: Reference source not found      Hình 16. Tác động của tấm tế  bào gốc mơ mỡ  lên sự  tăng sinh của tế  bào sừng                                                                                  Error: Reference source not found      Hình 17. Tế  bào sừng độ  che phủ đạt 100% , tế  bào sừng hinh ovan và đa di ̀ ện   moc day xêp khit nhau ngay tr ̣ ̀ ́ ́ ước khi tạo vết cạo để  đồng ni cấy với tấm tế   bào gốc mỡ và tấm ngun bào sợi (50X)              Error: Reference source not found      Hình 18.  Ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ  lên di cư  và biệt hóa của tế  bào sừng   (50X).                                                                            Error: Reference source not found   Hình 19. So sánh hình thái tế bào gốc mơ  mỡ…………………………….Error: Reference source not found DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AB Antibiotic/Antimycotic ­ Kháng sinh ADSCs Adipose­Derived Stem Cells ­ Tế bào gốc mỡ DMEM Dubeco’s Modified Eagle Medium EGF Epidermal Growth Factor ­ Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal Bovine Serum ­ Huyết thanh bào thai bê FGF  Fibroblasts Growth Factor ­ Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi HGF  Hepatocyte Growth Factor IL Interleukin ITS­X Insulin, Transferin, Selen ­ X KGF Keratinocyte Growth Factor ­ Yếu tố tăng trưởng tế bào sừng MCS Mesenchymal stem cells ­ Tế bào gốc trung mô P Passage­ Cấy chuyển PBS Phosphat Buffer Saline ­ Dung dịch đệm phosphat PDGF   Pletelet­Derived Growth Factor  TB Tế bào TGF  Transforming Growth Factor VEGF Vessle Endothelial Growth Factor ĐẶT VẤN ĐỀ Tế  bào gốc là một trong những lĩnh vực sinh học lơi cuốn nhất hiện  nay. Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đã được y học thế giới lựa chọn như là liệu  pháp hữu hiệu để chữa khỏi một số căn bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan   đến máu, tủy, xương khớp…Trên thế giới, có một số nguồn tế bào gốc được  đưa vào  ứng dụng như  tế bào gốc tủy xương và tế  bào gốc máu cuống rốn,   các tế bào gốc từ 2 nguồn này chủ  yếu là tế  bào gốc tạo máu nên được ứng   dụng trong nghiên cứu và điều trị các bệnh về máu, còn các bệnh cần có sự tái  tạo thuộc hệ thống trung mơ thì ít được ứng dụng. Trong khi đó, các bệnh của   trung mơ lại rất thường gặp như các vết thương, vết lt, bệnh lý hệ  mạch,  não, tim…Một nguồn TB gốc khác đang được kỳ  vọng nhiều chính là tế  bào  gốc phơi, mặc dù có tiềm năng lớn nhưng việc nghiên cứu và sử dụng còn rất  khó khăn về cơng nghệ và đặc biệt là bị cản trở bởi vấn đề y đức (sử dụng tế  bào gốc phơi đồng nghĩa với việc hủy đi một phơi vốn có thể  trở  thành một   con người). Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác các tế  bào gốc từ  phần phụ của thai như bánh rau, dây rốn. Thành cơng về cơng nghệ đã có thể  tách và nhân lên các tế  bào gốc nhưng chỉ  có những bệnh nhân có bảo quản   dây rốn – bánh rau…khi sinh ra mới có hy vọng được dùng các nguồn tế bào  gốc này. Hiện nay, chỉ  có số  lượng rất ít người được lưu giữ  dây rốn hay  bánh rau sau khi sinh ra, đồng thời chi phí cũng rất tốn kém và xác suất người  lưu trữ  mơ lại có các bệnh cần được điều trị  bằng các tế  bào gốc này cũng   khơng phải cao.  Tế  bào gốc mỡ  là quần thể  tế  bào vạn năng, chúng có thể  biệt hóa  thành nhiều dòng khác nhau. Mơ mỡ là loại mơ có sẵn với số lượng lớn và dễ  dàng thu hồi nên đây là nguồn tế  bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong   tương lai có thể sử dụng để ghép tự thân và đặc biệt là khơng gặp phải những  vấn đề y đức. Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào  gốc mơ mỡ  là một trong những dạng tế  bào quan trọng di cư  đến vùng tổn  thương để  thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của q trình liền vết   thương.  Tế  bào gốc trung mơ đã được nghiên cứu tách từ  mơ mỡ  nhưng trong  thành phần tế bào được tách còn nhiều dạng tế bào khác như bạch cầu, hồng   cầu…Tỷ  lệ  tế  bào gốc trung mơ thay đổi nên khó xác định chính xác cần sử  dụng bao nhiêu tế bào là cần thiết và bao nhiêu tế  bào trong hỗn dịch tế bào  mới tách là đủ  để  cho một lần ghép điều trị  vết thương. Do đó, cần nghiên  cứu xây dựng hồn chỉnh quy trình tách và tinh lọc tế bào gốc trung mơ. Nếu  như các tế bào gốc trung mơ tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di  cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho   việc tiếp tục các nghiên cứu  ứng dụng tế  bào gốc mơ mỡ  trên lâm sàng và  định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều   trị  các tổn thương thuộc hệ  thống trung mơ đặc biệt là vết thương và vết  bỏng.  Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thương bằng ghép tế bào gốc là rất lớn,   cụ thể tại Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang   các vết thương mạn tính. Hàng năm tại miền tây Châu Âu có khoảng 150.000  người cần được điều trị  bằng da nhân tạo. Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu   người bị lt và chi phí lên tới hơn 1 tỷ Euro dành cho điều trị.  Tại Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn về  bỏng [8]. Tuy chưa có con số  thống kê cụ  thể  nhưng chỉ  tính riêng tại Viện   Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị  thì nhu  cầu về ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào  gốc mỡ, chúng tơi tiến hành nghiên cứu:  “Nghiên cứu khả  năng tăng sinh   có biểu hiện tính tương hợp tế bào tuyệt vời và có thể được sử  dụng như tá   dược trong cơng nghệ mơ [83]. Việc ni cấy in vitro các tế bào gốc mỡ trên  đệm màng ối đã loại bỏ tế bào và giá đỡ acid hyaluronic liên kết chéo cũng đã   được mơ tả. Các tế  bào kết dính trên đệm màng  ối được thúc đẩy khả  năng   tăng sinh và khả năng sống, trong khí đó, các tế bào khơng kết dính trong gel   acid hyaluronic liên kết chéo lại tăng khả năng biệt hóa [29], [30]. Altman và  cộng sự đã mơ tả cách ni cấy tế bào gốc mỡ  trên giá đỡ  Fibril và Chitosan   và cho thấy các tế bào gốc mỡ người cấy trên các dạng giá đỡ này có tác dụng   thúc đẩy q trình liền vết thương và chúng tăng biệt hóa thành ngun bào  sợi, tế bào nội mơ và tế bào biểu mơ của mơ được khơi phục [16].  Trong các nghiên cứu trước đây, những cách chúng tơi đã sử dụng đối với   tế bào da là tạo thành những tấm tế bào mà ở đó các tế bào có sự liên kết với   nhau hoặc tạo thành tấm tế bào với sự hỗ trợ của các loại giá đỡ  khác nhau   Với cách thức này, tế  bào có đặc tính là  ổn định về  khả  năng sống và phân   chia như  khi chúng còn đang trong mơi trường ni cấy   labo. Trong điều  kiện đó, tấm tế bào được ghép lên vết thương thì chúng vừa có khả năng thực  hiện chức năng liền vết thương và vừa có khả  năng che phủ  bảo vệ  vết   thương. Cách thức này cũng thuận lợi hơn cho người thực hiện các thao tác về  kỹ thuật bởi chúng sẽ được ghép trên vết thương như một cuộc ghép tấm da  thông thường. Đối với nghiên cứu này, thiết kế nghiên cứu vẫn là cấy tế bào  trên một số  loại giá đỡ  polymer để  xác định khả  năng tế  bào gốc trung mô   phát triển tốt nhất nhằm tạo ra tấm tế bào phục vụ ghép trên vết thương.   Đề   tài   nghiên   cứu   trước     chúng       chế   tạo   thành   công     ngun bào sợi bằng cách cấy ngun bào sợi ni cấy trên lớp màng vật liệu  che phủ vết thương có bản chất là polyurethan [6]. Tuy nhiên mỗi loại tế bào   khác nhau thì rất có thể  khả  năng bám sống của chúng trên các loại vật liệu   cũng sẽ  khác nhau. Với thiết kế nghiên cứu truyền thống và nghiên cứu đặc   tính ni cấy của tế bào trung mơ, chúng tơi tiến hành thí nghiệm trên nhiều loại   vật   liệu   khác       nhận   thấy     vật   liệu   có     chất     polyurethan  (tegaderm) và vật liệu polymer có tráng collagen đều cho phép các tế  bào ni  cấy bám và phát triển trên đó.  Chúng tơi đã thí nghiệm về xác định khả năng bám, phát triển của tế bào  trên transwell. Transwell là loại đĩa ni cấy tế bào có sẵn lớp màng có thể dễ  dàng tách ra khỏi đĩa ni cấy. Lớp màng này có các vi lỗ  cho phép trao đổi   dinh dưỡng nhưng khơng cho phép tế  bào chui qua, với đặc tính này thì lớp  màng này có khả  năng che phủ  vết thương. Quan sát dưới kính hiển vi đảo  ngược thấy tế bào gốc trung mơ ni cấy trên đĩa transwell có thời gian để tế  bào bám sống sau cấy nhanh và cũng có thời gian tồn tại trên đĩa lâu. Chúng tơi   thí  nghiệm   đến   ngày   thứ   5   tế   bào  trên   đĩa   transwell     bám   tốt   Thí  nghiệm được tiếp tục cho đến nhiều ngày tiếp theo thì thấy khả năng sống và  phát triển của tế bào vẫn tốt tới ngày thứ 10­15 sau cấy.  Thơng thường nếu tế bào gốc trung mơ phát triển đạt 100% hoặc chồng   lớp lên nhau, thì khả năng tăng sinh và phát triển của tế bào gốc kém đi và có   thể hiện tượng biệt hóa xảy ra. Để đảm bảo tế bào gốc mỡ vẫn ở tình trạng   chưa biệt hóa và có tốc độ nhân lên vẫn giữ ngun, chúng tơi chỉ chế tạo tấm   tế bào với mật độ phủ kín bề  mặt ni cấy là 90%. Số lượng tế bào khi đạt  90% độ che phủ được xác định là: 5,3 ± 1,2 x 104/cm2 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu khả  năng tăng sinh của tế  bào gốc mỡ  và  ảnh hưởng  của chúng đến tế  bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị  vết thương tại   Labo nghiên cứu  ứng dụng trong điều trị bỏng ­Viện Bỏng Quốc Gia, tơi thu  được kết quả và rút ra kết luận sau: 1. Chúng tơi đã phân lập thành cơng tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ ­ Số lượng tế bào phân lập được đạt 2,46 ± 1,4x106TB/gram mơ.  ­ Các tế  bào có khả  năng tạo colony, các colony của tế bào gốc mơ mỡ  thuộc dạng CFU­F. Tỷ lệ tạo CFU­F của tế bào mới phân lập được là 14,6%.  Sau tinh lọc tế bào đến p5, tỷ lệ tạo CFU­F là 17,3% 2. Tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ có ảnh hưởng tích cực tới tế bào da ni cấy ­ Tế bào gốc mơ mỡ làm tăng sinh ngun bào sợi da ni cấy. Ngày thứ 2   đồng ni cấy TBG mơ mỡ  với ngun bào sợi da số  lượng NBS thu được là  6,8±0,5x104 tế bào/giếng 10cm2. Trong khi đó lơ chứng khơng có TBG mơ mỡ  đồng ni cấy, số lượng NBS thu được chỉ  từ 4.6±0,6 – 5,5±0,9x10 4 tb/giếng  10cm2 ­ Tế bào gốc mơ mỡ khơng làm tăng sinh tế bào sừng nhưng có tác động   tăng sự di cư và biệt hóa của tế bào sừng trong điều kiện ni cấy. Ngày thứ  5, tỷ  lệ  liền vết cạo khi  đồng ni cấy TBG mơ mỡ  với tế  bào sừng là  98,1±4,5%. Nhưng lơ chứng khơng có TBG mơ mỡ tỷ lệ tiền vết cạo chỉ đạt  75,0±12,4% ­ Tác động tích cực của tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ  đến các tế bào da   ni cấy là thơng qua chính khả năng sống của tế bào gốc và các yếu tố ngoại  bào.  KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu cấy ghép TB gốc mỡ trong điều trị vết thương, vết   bỏng 2. Tiếp tục nghiên cứu để chế tạo ra sinh phẩm từ TB gốc và ứng dụng   trong điều trị vết thương, vết bỏng TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt Trịnh Bình, Phạm Phan Địch, Đỗ  Kính (2002),  Mơ học, Nhà xuất bản y  học, Hà Nội Phùng Quốc Đại, Phạm Mạnh Hùng (1997),  “Sự  thay đổi các globulin  miễn dịch ở bệnh nhân bỏng”, Thơng tin bỏng, 2, tr. 27­28 Trần Văn Hanh (1997), “Quan điểm mơ học hiện đại trong q trình liền  vết thương”, Tài liệu đào tạo sau đại học – chun đề mơ học , Đại học Y  Hà Nội, tr. 141­156 Đinh Văn Hân, Nguyễn Thị Hương (2014), “Nghiên cứu chế tạo hỗn dịch  tế bào da tự thân khơng qua ni cấy dể điều trị vết thương và vết bỏng”,   Tạp chí y học thảm học & Bỏng, 3, tr. 40 ­ 48 Đinh Văn Hân, Trần Ngọc Diệp, Nguyễn Tiến Dũng (2013). “Đánh giá tác  dụng dung dịch chiết ngun bào sợi da ni cấy trong điều trị vết thương  mạn tính”, Tạp chí y học thảm hoạ & Bỏng, 2, tr 47 – 54 Nguyễn Văn Huệ, Đinh Văn Hân và CS (2006),  Hợp tác nghiên cứu áp   dụng cơng nghệ  ni cấy ngun bào sợi trong điều trị  vết thương vết   bỏng, Đề tài cấp nhà nước về Nghị định thư hợp tác với Liên Bang Nga Nguyễn Văn Huệ, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Hải An (2000),   “Nhận  xét về giảm bạch cầu máu ngoại vi  ở trẻ em bỏng nặng”,  Tạp chí thơng   tin y dược, 10, tr. 92­96 Nguyễn Viết Lượng (2009),  “Tình hình bỏng tại Việt Nam trong 3 năm  2005 ­2007”, Tạp chí y học thảm hoạ & bỏng, 1, tr. 26 Phạm Quang Ngọc (1990), “Màng  ối được đơng khơ và diệt khuẩn bằng  tia gama dùng làm băng sinh học để điều trị vết bỏng”,  Tạp chí Y học thực   hành, (2)285, tr. 23 10 Phạm Đình Phú (1994),  “Ghép da đồng loại 3 lần góp phần cứu sống 1   bệnh nhân bỏng sâu diện rộng”, Thơng tin bỏng, 2, tr. 17 11 Nguyễn Hữu Phùng, Dương Ngọc (1994),  “Sử  dụng da  ếch và màng  ối  đông khô trong điều trị bỏng nặng”, Thông tin bỏng, 2, tr. 15­16 12 Đỗ  Quang, Đỗ  Quang Hùng (1995), “Sử  dụng lâm sàng màng  ối đơn của   người làm băng sinh học chữa bỏng và các bệnh mất da”,  Thông tin bỏng,  1, tr. 16­18.  13 Lê Thế Trung (2003), Bỏng những kiến thức chuyên ngành, NXB Y Học 14 Trần Ngọc Tuấn, Đặng Tất Hùng (1996),  “Ứng dụng ghép da mắt lưới  kết hợp da tự  thân với da dị  loại trong bệnh nhân bỏng sâu diện rộng”,  Thông tin bỏng, 3, tr. 17­20.     B. Tiếng Anh    15 Akino   K,   Mineda   T,   Akita   S   (2005),   “Early   cellular   changes   of   human  mesenchymal   stem   cells   and   their   interaction   with   other   cells”,  Wound   Repair Regen, 13, pp. 434–440 16 Altman   AM,   Yan   Y,   Matthias   N,   et   al   (2008)   IFATS   Series:   “human  adipose­derived stem cells seeded on a silk fibroin­chitosan scaffold enhance  wound repair in a murine soft tissue injury model”, Stem Cells.  17 Alvarez­Diaz. C, Cuenca­Pardo. J, Sossa­Serrano. A (2000), “Burns treated  with   frozen   cultured   human   allogeneic   epidermal   sheets”,  J   Burn   Care   Rehabil, 21, pp. 291–299 18 Armour   A,   Scott   P.G,   Tredget   E.E,   (2007),   “Cellular   and   molecular  pathology of HTS: basis for treatment, Wound Repair Regen, 15 (Suppl. 1),  S6–S17.  19 Ayyappan   T,   Chadha   A,   Shaikh   MF   et   al   (2004)   “Topically   applied  autologous bone marrow in healing of chronic non­healing raw areas­a pilot  study”, Indian J Burns 2004, 12, pp 42­7 20 Barrientos   S,   Stojadinovic   O,   Golinko   M.S,   Brem   H,   Tomic­Canic   M.  (2008), “Growth factors and cytokines in wound healing”,  Wound Repair   Regen, 16, pp. 585–601 21 Brem   H,   Golinko   MS,   Stojadinovic   O   et   al   (2008),   “Primary   cultured  fibroblasts   derived   from   patients   with   chronic   wounds:   a   methodology   to  produce  human  cell   lines  and  test   putative   growth  factor  therapy  such  as  GMCSF”, Journal of Translational Medicine 75(6) 22 Chen   L,   Tredget   E.E,   Wu   P.Y,   Wu   Y   (2008),   “Paracrine   factors   of  mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells  and enhance wound healing”, PLoS ONE 3, e1886 23 Clark Richard A.F. (1993), “Basic of cutaneous wound repaire”, J Dermatol   surg Oncol, 19(12), pp. 116­122 24 Cohen I.K, Diegelman R.F, Crossland M.C, (1994), Wound care and wound  healing, Sprnciples of Surgery, 1, pp. 279­304 25 Diegelmann R.F, Evans M.C. (2004), “Wound healing: an overview of acute,  fibrotic and delayed healing”, Front. Biosci, 9, pp. 283–289 26 Falanga V, Iwamoto S, Chartier M, Yufit T, Butmarc J, Kouttab N, Shrayer  D,   Carson   P   (2007),   “Autologous   bone   marrow­derived   cultured  mesenchymal   stem   cells   delivered   in   a   fibrin   spray   cceleratehealing   in  murine and human cutaneous wounds, Tissue Eng”, 13, pp. 1299–1312 27 Falkenberg F.W, Weichert M, Krane H, Bartels I, Palme M, Nagels H.O,  Fiebig   H   (1995),   “In   vitro   production   of   monoclonal   antibodies   in   high  concentration   in   a   new   and   easy   to   handle   modular   minifermenter”,  J.  Immunol. Meth, 179, pp. 13–29 28 Fitzpatrick RE, Rostan EF (2003), “Reversal of photodamage with topical  growth factors: a pilot study”, J Cosmet Laser Ther, 5, pp. 25—34 29 Flynn   LE,   Prestwich   GD,   Semple   JL,   et   al   (2007)   “Adipose   tissue  engineering with naturally derived scaffolds and adiposederived stem cells”,  Biomaterials  2007, (28), pp. 34­42 30 Flynn   LE,   Prestwich   GD,   Semple   JL,   et   al   (4/2008)  “Proliferation   and  differentiation of adipose­derived stem cells on naturally derived scaffolds”,  Biomaterials, (29), pp. 1862­71 31 Friedenstein. A.J, Chailakhyan. R.K, Latsinik. N.V, Panasyuk. A.F. (1974).  “Keiliss­Borok,   Stromal   cells   responsible   for   transferring   the  microenvironment   of   the   hemopoietic   tissues   Cloning   in   vitro   and  retransplantation in vivo”, Transplantation, 17, pp. 331–340 32 Han S.K, Yoon T.H, Lee D.G et al (2005). “Potential of human bone marrow  stromal cells to accelerate wound healing in vitro”, Ann Plast Surg 2005, 55,   pp. 41­49 33 Hansbrough JF, Mozingo DW, Kealey GP, Davis M, Gidner A, Gentzkow  GD  (1997),  “Clinical  trials   of  a  biosynthetic  temporary  skin  replacement,  Dermagraft­   Transitional   Covering,   compared   with   cryopreserved   human  cadaver skin for temporary coverage of excised burn wounds", J Burn Care   Rehabi 1997 Jan­Feb, 18 (1 Pt1), pp. 43­51 34 Hehenberger   K,   Kratz   G,   Hansson   A,   Brismar   K   (1998),   “Fibroblasts  derived from human chronic diabetic wounds have a decreased proliferation  rate, which is recovered by the addition of heparin”, J. Dermatol. Sci, 16, pp.  144–151 35 Herndon D.N, Barrow R.E, Rutan R.L, Rutan T.C, Desai M.H, Abston S.  (1989), “A comparison of conservative versus early excision. Therapies in  severely burned patients”, Ann. Surg, 209, pp. 547–5528 discussion 552–543 36 Hu R, Ling W, Xu W, Han D. (2014), “Fibroblast­Like Cells Differentiated  from   Adipose­Derived   Mesenchymal   Stem   Cells   for   Vocal   Fold   Wound  Healing”, PLoS ONE 9(3): e92676 37 Humpert PM, Bastsch U et al (2005), “Locally applied mononuclesr bone  marrow cells restore angiogenesis and promote wound healing in a type 2  fiabetic patient”, Exp Clin Endocrinol Diabetes 2005, 113, pp. 538­40 38 Hunt T.K. (1990), “Basic principles of wound healing”, J  Trauma ,30(12),  pp. 122­128 39 Hyoju   Kim,   Kyuseok   Choi,   Oh­Kyeong   Kweon,   Wan   Hee   Kim   (2012),  “Enhanced   wound   healing   effect   of   canine   adipose­derived   mesenchymal  stem   cells   with   low­level   laser   therapy   in   athymic   mice”,  Journal   of   Dermatological Science, 68, pp. 149–156 40 John F Hasbrough, Hans Oliver Rennekampff (1998), “Cultured skin cell for  wound closure and for promoting wound healing. Growth factor and wound  healing basic science and potential clinical application”,  Serono Symposia   USA Norwell, Massachusetts, pp 37­55.   41 Jurgens WJ, Oedayrajsingh­Varma MJ, Helder MN, et al (6/2008), “Effect of  tissue­harvesting   site   on   yield   of   stem   cells   derived   from   adipose   tissue:  implications for cell­based therapies”, Cell Tissue Res, (26), pp 332:415.  42 Khachemoune. A, Bello. Y.M, Phillips. T.J (2002), “Factors that influence  healing in chronic venous ulcers treated with cryopreserved human epidermal  cultures”, Dermatol. Surg, 28, pp. 274–280 43 Kim   W.S,   Lee   JJ,   Jung   DY,   Jeon   J,   Heo   HS,   Kang   HC,   et   al   (2006),  “Profiling of differentially expressed genes in human stem cells by cDNA  microarray”, Mol Cells, 21, pp. 343—55 44 Kiristy   CP,   Lynch   AB,   Lynch   SE   (1993),   “Role   of   growth   factors   in  cutaneuos wound healing: a review”, Crit Rev Oral Bio Med, 4, pp. 729­760 45 Lauffenburger   D.A,   Horwitz   A.F   (1996),   “Cell   migration:   a   physically  integrated molecular process”, Cell, 84, pp. 359–369 46 Lerman   O.Z,   Galiano   R.D,   Armour   M,   Levine   J.P,   Gurtner   G.C   (2003),  “Cellular   dysfunction   in   the   diabetic   fibroblast:   impairment   in   migration,  vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia”, Am   J. Pathol, 162, pp. 303–312 47 Li Y, Fan J, Chen M, Li W, Woodley D.T. (2006), “Transforming growth  factor­alpha: a major human serum factor that promotes human keratinocyte  migration”, J. Invest. Dermatol, 126, pp. 2096–2105 48 Loots   M.A,   Lamme   E.N,   Mekkes   J.R,   Bos   J.D,   Middelkoop   E   (1999),  “Cultured fibroblasts from chronic diabetic wounds on the lower extremity  (non­insulin­dependent   diabetes   mellitus)   show   disturbed   proliferation”,  Arch. Dermatol. Res, 291, pp. 93–99 49 Lu F, Gao JH, Ogawa R, et al (2006 Dec), “Adipose tissues differentiated by  adipose­derived   stem   cells   harvested   from   transgenic   mice”,  Chin   J   Traumatol, 9, pp. 359­64 50 MacNeil S (2007), “Progress and opportunities for tissue­engineered skin”,  Nature 445, pp. 874–880 51 Martin   M.J   et   al   (2005),   “Human   embryonic   stem   cells   express   an  immunogenic nonhuman sialic acid”, Nat Med, 11(2), pp. 228­32 52 Masakazu Ishii, Chika Koike et al (2005), “Molecular markers distinguish  bone marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts”,  Biochemical and   Biophysical Research Communications, 332, pp. 297–303 53 McFarlin K, Gao X, Liu Y.B, Dulchavsky D.S, Kwon D, Arbab A.S, Bansal  M, Li Y, Chopp M, Dulchavsky S.A, Gautam S.C (2006), “Bone marrow­ derived mesenchymal stem cells accelerate wound healing in the rat”, Wound   Repair Regen, 14, pp. 471–478 54 Midwood K.S, Williams L.V, Schwarzbauer J.E. (2004), “Tissue repair and  the dynamics of the extracellular matrix”, Int. J. Biochem. Cell Biol, 36, pp.  1031–1037 55 Papini R. (2004), “Management of burn injuries of various depths”, BMJ  329, pp. 158–160 56 Pereira R.F, Halford K.W, O’Hara M.D, Leeper D.B, Sokolov B.P, Pollard  M.D, Bagasra O, Prockop D.J. (1995), “Cultured adherent cells from marrow  can   serve   as   long­lasting   precursor   cells   for   bone,   cartilage,   and   lung   in  irradiated mice”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, pp. 4857–4861 57 Phan TT, et al (2005), “Evaluation of cell culture on the polyurethane­based  membrane   (Tegaderm):   implication   for   tissue   engineering   of   skin”,  Cell   Tissue Bank, 6(2), pp. 91­7 58 Phinney D.G, Prockop D.J. (2007), “Mesenchymal stem/multipotent stromal  cells; the state of transdifferentiation and modes of tissue repair — current  views”, Stem Cells, 25, pp. 2896–2902 59 Ponec M. (2002), “Skin constructs for replacement of skin tissues for in vitro  testing”, Adv.Drug Deliv. Rev, 54 (Suppl 1), S19–S30 60 Postlethwaite   A.E,   Keski­Oja   J,   Moses   H.L,   Kang   A.H   (1987),  “Stimulation   of   the   chemotactic   migration   of   human   fibroblasts   by  transforming growth factor beta”, J. Exp. Med, 165, pp. 251–256 61 Purdue G.F, et al (1997), “A Multi­center Clinical Trial of a Biosynthetic  Skin Replacement, Dermagraft­TC, Compared with Cryopreserved Human  Cadaver Skin for Temporary Coverage of Excised Burn Wounds”, Journal of   Burn Care and Rehabilitation, 18(1), 52­57 62 Reckhenrich A.K, Kirsch B.M, Wahl E.A, Schenck T.L, Rezaeian F, et al.  (2014), “Surgical Sutures Filled with Adipose­Derived Stem Cells Promote  Wound Healing”, PLoS ONE 9(3): e91169 63 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld­Clauss S, Temm­Grove CJ, Bovenkerk  JE, et al (2004). “Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human  adipose stromal cells”, Circulation, 109, 1292—8 64 Rubin JP, Bennett JM, Doctor JS, et al (2007 Aug),  Plast Reconstr Surg,  120:414­24 65 Sasaki   M,   Abe   R,   Fuita   Y,   Ando   S,   Inokuma   D,   Shimizu   H   (2008),  “Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to  wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type”, J. Immunol,  180, pp. 2581–2587 66 Schade   R,   Pfister   C,   Halatsch   R,   Henklein   P   (1991),   “Polyclonal   IgY  Antibodies from Chicken Egg Yolk—An Alternative to the Production of  Mammalian IgG type Antibodies in Rabbits”,  Fund for the Replacement of   Animals in Medical Experiments, ATLA, Nottingham, pp. 403–419 67 Schaffer CJ, Narrey LB (1996), “Cell biology of wound healing”,  Int Rev   Cytol, 169, pp. 151­181 68 Seibold J.R, Uitto J, Dorwart B.B, Prockop D.J. (1985), “Collagen synthesis  and collagenase activity in dermal fibroblasts from patients with diabetes and  digital sclerosis”, J. Lab. Clin. Med, 105, pp. 664–667 69 Sheng­Ping Huang, Chun­Hsiang Huang, Jia­Fwu Shyu, Herng­Sheng Lee4,  Shyi­Gen   Chen,   James   Yi­Hsin   Chan   and   Shih­Ming   Huang   (2013),  “Promotion of wound healing using adipose­derived stem cells in radiation  ulcer of a rat model”, Journal of Biomedical Science, pp. 20­51 70 Sheridan R.L, Tompkins R.G (1999), “Skin substitutes in burns”, Burns 25,  pp. 97­103.   71 Smith   A.N,   Willis   E,   Chan   V.T,   Muffley   L.A,   Isik   F.F,   Gibran   N.S,  Hocking   A.M  (2010),  “Mesenchymal  stem   cells  induce  dermal  fibroblast  responses to injury”, Exp. Cell Res, 316, pp. 48–54 72 Supp D.M, Boyce S.T. (2005), “Engineered skin substitutes: practices and  potentials”, Clin. Dermatol, 23, pp. 403–412 73 Togel   F,   Weiss   K,   Yang   Y,   Hu   Z,   Zhang   P,   Westenfelder   C   (2007),  “Vasculotropic,   paracrine   actions   of   infused   mesenchymal   stem   cells   are  important to the recovery from acute kidney injury”,  Am J Physiol Renal   Physiol , (292), F1626–F1635 74 Vacanti. C.A, Mikos. A.G (1995), Tissue Eng, 1, pp. 1–2 75 Valbonesi   M,  Giannini   G,   et   al   (2004),   “Cord   blood  (CB)   stem   cells   for  wound repaire”,  Transfus Apher Sci 2004, 30:153­6 76 Wahl LM, Wahl SM (1992),   Inflamation. In: Cohen IK, Diegelmann RF,  Lindblad   WJ,   et   all  Wound   Healing   Biochemical   and   Clinical   Aspects,  Philadelphia, PA: WB. Saunders Company, pp.  40­60 77 Wainwright   D.J   (1995),   “Use   of   an   acellular   allograft   dermal   matrix  (AlloDerm) in the management of full­thickness burns”, Burns, 21, pp. 243– 248 78 Wall   S.J,   Sampson   M.J,   Levell   N,   Murphy   G   (2003),   “Elevated   matrix  metalloproteinase­2   and   ­3   production   from   human   diabetic   dermal  fibroblasts”, Br. J. Dermatol, 149, pp. 13–16 79 Werner   S,   Richard   G   (2003),   “Regulation   of   Wound   Healing   by   Growth  Factors and Cytokines”, Physiol. Re, 83, pp. 835­870 80 Woodley   D.T,   Peterson   H.D,   Herzog   S.R,   Stricklin   G.P,   Burgeson   R.E,  Briggaman R.A, Cronce D.J, O'Keefe E.J (1988), “Burnwounds resurfaced  by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring  fibrils”, JAMA, 259, pp. 2566–2571 81 Won­Serk Kim, Byung­Soon Park, Jong­Hyuk Sung, Jun­Mo Yang, Seok­ Beom   Park,   Sahng­June   Kwak,   Jeong­Soo   Park  (2007),   “Wound   healing  effect of adipose­derived stem cells: A critical role of secretory factors on  human dermal fibroblasts”. Journal of Dermatological Science, 48, pp. 15— 24 82 Wu Y, Chen L, Scott P.G, Tredget E.E. (2007), “Mesenchymal stem cells  enhance   wound   healing   through   differentiation   and   angiogenesis”,  Stem   Cells, 25, pp. 2648–2659 83 Zhang YS, Gao JH, Lu F, et al (2007 Feb),  ‘‘Cellular compatibility of type  collagen I scaffold and human adipose­derived stem cells”, Nan Fang Yi Ke   Da Xue Xue Bao, 27:223­5 84 Zuk   PA,   Zhu   M,   Ashjian   P,   De   Ugarte   DA,   Huang   JI,   Mizuno   H,   et   al  (2002), “Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells”,  Mol   Biol Cell, 13:4279—95 85 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, et al (2001),  “Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell­based  therapies”, Tissue Eng, 7:211—28 ...   Nghiên cứu khả năng tăng sinh   của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da ni cấy định   hướng trong điều trị vết thương  nhằm mục tiêu sau: Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ĐỒN HỒNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ  BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN  TẾ BÀO DA NI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG... tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong   điều kiện nuôi cấy invitro Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy Chương 1  TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương