Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của cây chuối hột Musra barjoo Sieb lên chuột gây tiểu đường type 2

Luận văn với mục tiêu nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết các phân đoạn quả và củ chuối hột trên mô hình chuột gây ĐTĐ type 2; phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất hóa học có trong dịch chiết các bộ phận cây chuối hột.

Luận văn Thạc sĩ khoa học MỞ ĐẦU Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh phổ biến nước phát triển nước phát triển, nước ta bệnh có xu hướng tăng dần Cùng với bệnh ung thư tim mạch, ĐTĐ ba bệnh có số người mắc tăng nhanh ĐTĐ có tỉ lệ tử vong cao bệnh nội tiết gây nhiều biến chứng nguy hiểm Bệnh có nguyên nhân nội tiết với biểu rối loạn chuyển hóa, điển hình tăng glucose huyết thiếu hụt insulin tuyệt đối tương đối hay không đáp ứng với insulin Bệnh thường kèm theo biến chứng cấp gây tử vong biến chứng lâu dài bệnh lý tim mạch, mắt, thận, thần kinh [1, 5, 31] Ở Việt Nam, bệnh nhân mắc bệnh mãn tính thường có xu hướng sử dụng thuốc Đơng Y thuốc Y học cổ truyền chúng có độc tính thấp, rẻ tiền sẵn có Sử dụng cỏ vườn nhà để làm thuốc truyền thống lâu đời dân tộc ta, để lại kinh nghiệm q báu chăm sóc bảo vệ sức khỏe cho nhân dân Chuối hột (Musra barjoo Sieb) lồi có mặt nhiều nơi đất nước ta Nhân dân ta theo kinh nghiệm dân gian để chữa số bệnh như: hắc lào, đau răng, sỏi thận, trĩ, mụn nhọt, tiêu chảy, ĐTĐ, … phận khác Để góp phần làm sáng tỏ tác dụng điều trị ĐTĐ chuối hột, tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả hạ đường huyết chuối hột Musra barjoo Sieb lên chuột gây tiểu đường type 2” với mục tiêu: - Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết phân đoạn củ chuối hột mơ hình chuột gây ĐTĐ type - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất hóa học có dịch chiết phận chuối hột Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Chương TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm Đái tháo đường (Diabetes mellitus) bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng nồng độ glucose máu tăng thường xuyên mãn tính tụy sản xuất thiếu insulin (thiếu insulin tuyệt đối) giảm tác dụng insulin (thiếu insulin tương đối) nguyên nhân khác với chế bệnh sinh phức tạp [1, 5] Tăng glucose máu mãn tính thường kết hợp với hủy hoại, rối loạn suy yếu chức nhiều quan thể Những rối loạn chuyển hóa gây mê tử vong thời gian ngắn không điều trị kịp thời Hậu muộn rối loạn chuyển hóa gây tổn thương mạch máu nhỏ mạch máu lớn dẫn đến mù mắt, hoại tử thận, hoại tử chi, nhiễm trùng, tổn thương thần kinh [5, 30] 1.1.2 Phân loại chế bệnh sinh Hơn 2000 năm trước, bệnh ĐTĐ mô tả y văn cổ, kể từ đến có nhiều cách phân loại bệnh ĐTĐ khác Trải qua nhiều thời kỳ, ĐTĐ nhà nghiên cứu phân chia thành nhiều loại khác Đến năm 1980 chuyên gia nghiên cứu bệnh ĐTĐ WHO phân loại bệnh ĐTĐ dựa vào tiêu lâm sàng, dịch tễ học yếu tố di truyền Sự phân loại bổ sung thay đổi chút vào năm 1985, phân thành ĐTĐ phụ thuộc insulin (loại bắt buộc phải dùng insulin) ĐTĐ không dùng thuốc chữa [5, 13, 14] Cho đến năm 1997, Ủy ban chuyên gia chuẩn đoán phân loại bệnh ĐTĐ WHO đưa đề nghị cách phân loại bệnh ĐTĐ dựa Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học tiến khoa học dựa vào nguyên nhân sinh bệnh dùng phổ biến đến ngày ĐTĐ chia thành hai loại sau [5, 14]: 1.1.2.1 Bệnh đái tháo đường type Bệnh ĐTĐ type gọi bệnh ĐTĐ phụ thuộc insulin (Insulin-dependent diabete), qua trung gian miễn dịch, dạng khởi phát lứa tuổi vị thành niên Hệ thống miễn dịch thể sinh kháng thể chống lại phá hủy tế bào β đảo tụy sản xuất insulin Khi khơng có insulin, tế bào khơng sử dụng glucose, glucose máu tăng cao thường dẫn đến biến chứng lâu dài Nghiên cứu cặp sinh đôi trứng, tỷ lệ ĐTĐ type cặp từ 30 – 40% Điều chứng tỏ tất trường hợp di truyền có yếu tố mơi trường biểu bệnh Một số yếu tố môi trường làm thay đổi chức tế bào  như: virus (quai bị, rubella, coxsackie virus B4); số chất hóa học (thuốc diệt chuột nitrophenylurea) chất phá hủy tế bào (hydrogen cyanid có tapioca bị hỏng sắn) Gen nhạy cảm với bệnh ĐTĐ người chủ yếu nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể số ĐTĐ type xảy độ tuổi nào, thường gặp trẻ em niên Người bị ĐTĐ type bắt buộc phải dùng insulin ngày để điều hòa hàm lượng glucose máu Ngồi người bệnh phải phối hợp sử dụng thuốc với chế độ dinh dưỡng tập luyện hợp lý giúp ổn định lượng glucose huyết, kéo dài sống [1, 5, 10, 14, 15] 1.1.2.2 Bệnh đái tháo đường type Đây dạng ĐTĐ thường gặp nhất, chiếm khoảng 80-90% số bệnh nhân bị ĐTĐ Thông thường, với bệnh ĐTĐ type 2, thể sản Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học xuất insulin, insulin sản xuất không đủ tế bào khơng thể sử dụng Điều gọi đề kháng insulin Theo thời gian, đường huyết tăng cao máu Hiện tượng kháng insulin tập trung nhiều gan loại mô ngoại vi với nhiều hình thức kháng khác như: giảm khả ức chế sản xuất glucose gan, giảm khả thu nạp glucose mô ngoại vi, giảm khả sử dụng glucose quan Do đó, xét nghiệm, người ta thấy có mặt insulin máu Ngoài ra, nồng độ insulin máu số bệnh nhân ĐTĐ type cao, nguyên nhân bệnh nhân này, tế bào đích khơng đáp ứng với insulin đáp ứng mức độ thấp, nên nồng độ insulin phải cao mức bình thường đưa đến đáp ứng bình thường [1, 5, 14, 15] ĐTĐ type diễn biến theo giai đoạn sau: + Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose máu mức bình thường, bắt đầu có tượng kháng insulin hàm lượng insulin tăng cao bình thường máu + Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng mạnh dần xuất hiện tượng tăng nồng độ glucose máu sau bữa ăn + Giai đoạn 3: Sự kháng insulin không thay đổi tiết insulin giảm dần gây tăng nồng độ glucose huyết lúc đói Các triệu chứng bệnh ĐTĐ bắt đầu biểu bên ngồi ĐTĐ type có tính di truyền mạnh, có nghĩa bệnh có khuynh hướng phát triển theo gia đình Một số loại gen xác định số khác giai đoạn nghiên cứu nghi ngờ nguyên nhân gây ĐTĐ type Tuy nhiên đời sống ngày, có nhiều yếu tố nguy dẫn đến bệnh ĐTĐ type đề cập đến, bao gồm như: tăng huyết áp, tăng triglyceride (mỡ) máu, ĐTĐ thai kỳ sinh nặng 4kg, chế Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học độ ăn nhiều chất béo, uống nhiều rượu, ngồi nhiều, béo phì thừa cân, chủng tộc, đặc biệt có người thân bị ĐTĐ type bị ĐTĐ thai kỳ, tuổi tác Trong đó, béo phì vận động hai yếu tố nguy nhắc đến nhiều làm phát triển bệnh ĐTĐ type [5, 13] 1.1.2.3 Một số loại ĐTĐ khác Ngoài hai loại ĐTĐ thường gặp ĐTĐ type ĐTĐ type người ta phân biệt số loại bệnh ĐTĐ khác như: ĐTĐ thai kỳ: Đây dạng ĐTĐ xảy số phụ nữ mang thai biến sau sinh Có thể gây biến chứng cho mẹ trình mang thai Phụ nữ bị ĐTĐ thai kỳ có nhiều khả phát triển thành bệnh ĐTĐ type [13] Một số type ĐTĐ khác: Một bệnh nhân có đồng thời nhiều đặc điểm nhiều type khác Ví dụ, ĐTĐ tự miễn âm ỉ (latent autoimmune diabetes in adults (LADA)), gọi ĐTĐ type 1.5 hay ĐTĐ đơi, bệnh nhân có đặc điểm ĐTĐ type type Phần lớn bệnh nhân LADA tiết đủ insulin chẩn đoán giống ĐTĐ type vòng vài năm sau bệnh nhân cần insulin để kiểm soát đường huyết Trong LADA, giống ĐTĐ type 1, tế bào  tuyến tụy không sản xuất insulin hệ thống miễn dịch thể công phá hủy tế bào  Các chuyên gia cho ĐTĐ LADA dạng diễn tiến chậm ĐTĐ type Nguyên nhân type ĐTĐ khác gây bởi: Khiếm khuyết gen tế bào , ĐTĐ khởi phát người trẻ (MODY) Bệnh tuyến tụy hay tổn thương tuyến tụy, viêm tụy hay xơ hóa tụy Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Sản xuất nhiều hormone đối kháng insulin bệnh lý khác như: hormone cortisol hội chứng Cushings; thuốc giảm hoạt động insulin glucocorticoids, hay hóa chất phá hủy tế bào ; nhiễm trùng, bệnh sởi hay virus cytomegalo bẩm sinh; rối loạn tự miễn hiếm, hội chứng stiff-man, bệnh tự miễn hệ thần kinh trung ương [27] 1.1.3 Tỉ lệ mắc bệnh Trên giới, hàng năm có tới hàng triệu người mắc ĐTĐ Tỉ lệ phát triển bệnh gia tăng theo phát triển đời sống kinh tế, gây ảnh hưởng lớn tới phát triển kinh tế cộng đồng Hiện nay, ĐTĐ trở nên phổ biến nhiều nước giai đoạn đại hóa cơng nghiệp hóa Bệnh ĐTĐ chiếm tỉ lệ 3-7% người trưởng thành nước châu Âu Gần đây, WHO báo động toàn giới phát triển mối nguy hại bệnh này: Năm 1985 giới có 30 triệu người mắc ĐTĐ; đến năm 1994 số tăng lên 98,9 triệu người Năm 2003 có khoảng 140 triệu người mắc ĐTĐ Theo ước tính Viện Nghiên cứu ĐTĐ Quốc tế: năm 2025 có khoảng 300 triệu người mắc ĐTĐ [13, 22, 31] Ở Việt Nam, theo thống kê số bệnh viện thành phố lớn, ĐTĐ bệnh thường gặp có tỉ lệ tử vong cao bệnh nội tiết Tỉ lệ bệnh nhân điều trị tăng lên từ năm qua năm khác, thành thị cao nông thôn ĐTĐ type chiếm đa số bệnh nhân thường gặp người cao tuổi (90-95%) ĐTĐ type chiếm tỉ lệ nhỏ thường gặp người trẻ 40 tuổi [13, 22, 31] Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học 1.1.4 Các xét nghiệm hóa sinh chẩn đốn bệnh ĐTĐ 1.1.4.1 Glucose huyt Tháng năm 1997, hội nghị thường niên Hội ĐTĐ Mỹ Boston công bố tiêu chí chẩn đoán bệnh ĐTĐ Tiêu chí WHO công nhận vào năm 1998 Nội dung tiêu chí [13]: - Mẫu đường huyết tương 200mg/dl kết hợp với triệu chứng tăng đường huyết - Đường huyết tương lúc đói 126mg/dl (sau không ăn) - Đường huyết tương sau giê uèng 75g glucose  200mg/dl 1.1.4.2 Glucose niệu Ở người bình thường, nước tiểu khơng có đường Ngưỡng đường thận trung bình 160-180mg/ml (8,9-10mmol/l) Khi đường huyết tăng cao vượt ngưỡng đường thận tức vượt khả tái hấp thu glucose thận, glucose có nước tiểu Ngưỡng đường thận thay đổi khác cá thể Trong số trường hợp bệnh lý thận đường huyết bình thường có đường nước tiểu Ngược lại, người cao tuổi thường có ngưỡng đường thận cao nên thấy đường niệu đường huyết cao Do xét nghiệm glucose niệu có giá trị tiến hành đồng thời với xét nghiệm glucose huyết [5, 12, 14, 27] 1.1.4.3 Ceton niệu Thể ceton hình thành thể tăng phân hủy lipid tạo Thể ceton gồm thành phần: Acetoacetat, Aceton, β-Hydroxybutyrat; thành phần đào thải qua nước tiểu Ở người bình thường khơng có ceton nước tiểu Trong trường hợp nhiễm toan chuyển hóa ĐTĐ, thể đào thải nhiều ceton nước tiểu Đây dấu hiệu có giá trị báo trước cho tình trạng mê nhiễm toan Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Hiện nay, xác định glucose huyết, glucose niệu hay ceton niệu cách nhanh chóng, xác dụng cụ que thử glucose niệu, ceton niệu, máy kit đo glucose huyết [5, 12, 14, 27] 1.1.4.4 Định lượng insulin C-peptit máu Insulin C-peptit huyết định lượng phương pháp RIA (Radioimmuno Assay-Định lượng miễn dịch phóng xạ) ELISA C-peptit tiết tiền insulin (Proinsulin) từ tế bào β tiểu đảo tụy, yếu tố liên kết nhánh A B Proinsulin C-peptit tiết qua thận trạng thái nguyên vẹn, không bị biến đổi Định lượng C-peptit đánh giá xác khả tiết insulin tụy [5, 12, 14, 27] 1.1.4.5 Các xét nghiệm khác Ngồi xét nghiệm có xét nghiệm khác để chẩn đoán xác định theo dõi tiến triển bệnh điều trị như: HbA1c (Glycosylated hemoglobin), Albumin glycosylated protein huyết thanh, protein niệu, β2Microglobulin [5, 12, 14, 27] 1.1.5 Biến chứng ĐTĐ Biến chứng tim: biến chứng nặng, thường xơ cứng mạch vành gây đau thắt ngực, nhồi máu tim Biến chứng da: ngứa toàn thân, ngứa sinh dục, mụn nhọt da, u mỡ vàng, hoại tử mỡ, viêm da thể cứng bì teo Biến chứng mắt: nhiễm khuẩn mắt, liệt nhãn cầu gây nhìn đơi, viêm đỏ mống mắt, bệnh võng mạc, thiên đầu thống chảy máu, trường hợp nặng mù Hoại tử ĐTĐ: biến chứng muộn bệnh lâu ngày bị bỏ qua không điều trị Thường hoại tử chi tạng như: tim, võng mạc, não, thận Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Biến chứng thần kinh: đau dây thần kinh tọa, trụ; rối loạn cảm giác sâu, phản xạ gân xương; liệt Biến chứng thận: gây protein niệu, đái máu vi thể, hội chứng thận hư Biến chứng răng: biến chứng sớm, thường viêm lợi rụng Biến chứng phổi: áp xe phổi, biến chứng dễ gặp Hôn mê: biến chứng nặng thường gây tử vong Bệnh nhân hôn mê ĐTĐ hôn mê nhiễm toan, ceton, tăng thẩm thấu mê hạ glucose huyết liều insulin [5, 14, 27] 1.1.6 Điều trị ĐTĐ 1.1.6.1 Chế độ không dùng thuốc Chế độ ăn uống: việc điều trị ĐTĐ chế độ ăn cần tuân theo nguyên tắc: tổng số calo đưa vào phải cung cấp lượng tương xứng để đạt tới trì cân nặng tối ưu cho bệnh nhân giữ tình trạng sức khỏe tốt Vận động thể lực: vận động thể lực làm tăng nhạy cảm insulin tăng số lượng chất lượng receptor insulin tế bào Thể dục làm giảm số biến chứng bệnh [14, 27, 35] 1.1.6.2 Chế độ dùng thuốc Ở Việt Nam có hai hướng sử dụng thuốc là: 1.1.6.2.1 Sử dụng thuc tõn dc: Theo đường dùng nguồn gốc, thuốc hạ glucose máu chia thành hai nhóm chính: - Insulin - Các thuốc hạ glucose huyết đường uống a Insulin: Insulin ngoại sinh sử dụng tụy khơng sản xuất đủ insulin để điều hòa chuyển hóa glucid Insulin dùng điều trị ĐTĐ type Cao học khóa K17 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học type dùng thuốc uống hạ đường huyết khơng tác dụng Cơ chế tác dụng insulin bao gồm [14, 27, 35]: - Tăng cường vận chuyển glucose từ máu vào tế bào, tăng cường oxyhóa glucose tạo lượng chuyển glucose thành glycogen dự trữ - Tăng cường tổng hợp protein cách chuyển acid amin vào tế bào - Tăng cường chuyển hóa glucose thành chất béo dự trữ b Các thuốc hạ glucose huyết đường uống - Sulphonylurea: (tolbutamid, gliclazid) thuốc dùng bệnh nhân ĐTĐ type khơng béo phì Trong thể, Sulphonylurea gắn lên thụ thể đặc hiệu nằm màng tế bào β tiểu đảo Langerhan kích thích giải phóng insulin Khả kích thích giải phóng insulin sulphonylurea tế bào β phụ thuộc vào khả gắn với thụ thể Do sulphonylurea có tác dụng tế bào β không bị tổn thương [14, 27, 35] - Biguanide: (metformin) dùng cho bệnh nhân béo phì Thuốc làm tăng tác dụng insulin thụ thể sau thụ thể, tăng sử dụng glucose tổ chức ngoại vi, đặc biệt tế bào Thuốc làm giảm tạo glucose gan, giảm hấp thu glucose ruột Tuy nhiên, nhóm khơng có tác dụng tiết insulin tụy Do đó, nên phối hợp với sulphonylurea với insulin điều trị [35] - Các thuốc ức chế men α-glucosidase: (acarbose, miglitol) pseudotetrasaccharide có nguồn gốc từ vi khuẩn Ở niêm mạc ruột non, thuốc ức chế cạnh tranh men tiêu hóa tinh bột α-glucosidase, làm chậm hấp thu carbohydrate - Meglitinide: (repaglinide) thuốc làm giảm glucose huyết cách kích thích tiết insulin từ tế bào β tụy hoạt động - Thiazolidinedione hay Glitazon: (troglitazone, rosiglitazone) nhân tế bào mô nhạy cảm với insulin (mơ mỡ, mơ cơ, mơ gan) có Cao học khóa K17 10 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Trên sở này, tiến hành số thí nghiệm tiếp theo: phân tích số máu cholesterol, triglyxerit, GOT, GPT, GGT tiến hành phân lập hợp chất tự nhiên có phân đoạn n-hexan, xác định cấu trúc hóa học hợp chất 3.5 Kết phân tích số gan máu Với lô chuột thí nghiệm đối chứng chúng tơi tiến hành mổ để lấy kết trung bình 3.5.1 Một số số gan máu Chúng tiến hành lô chuột uống cao thô chuối hột chiết nước Mổ chuột lấy gan, máu (cho vào ống chống đông), gan rửa nước muối sinh lý, nghiền gan nước muối sinh lý với tỷ lệ 1:2, dịch nghiền đem ly tân 15.000 vòng/phút 15 phút 40C, thu dịch Dịch gan máu gửi để phân tích phòng Hóa sinh bệnh viện Medlatec phần giữ lại để xác định hoạt độ số enzym, kết thu bảng Bảng Kết phân tích gan máu Chỉ số Lô Glucose Cholesterol Triglyxerit (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) GOT GPT (U/L) (U/L) ĐTĐ + CQN 10.50 1.91 1.37 22.40 25.20 ĐTĐ 24.43 1.32 0.93 86.54 93.25 HFD 11.50 2.70 1.83 24.30 29.27 ND 5.420 0.51 0.72 22.30 18.10 Cao học khóa K17 50 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học 3.00 Nồng độ (mmol/l) 2.50 2.00 Cholesterol Triglyxerit 1.50 1.00 0.50 0.00 ĐTĐ + CQN ĐTĐ HFD ND Lơ chuột Hình Chỉ số triglyxerit cholesterol máu chuột Cholesterol triglyxerit số để đánh giá mức độ béo phì, khả dự trữ thể Dựa vào bảng ta thấy hàm lượng cholesterol triglyxerit chuột điều trị cao hẳn so với chuột ĐTĐ thấp chuột nuôi béo không bị ĐTĐ Cụ thể 1.91 1.37 so với 1.32 0.93 chuột ĐTĐ 2.7 1.83 chuột béo thường Cao học khóa K17 51 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học 100 90 Nồng độ (U/L) 80 70 60 GOT GPT 50 40 30 20 10 ĐTĐ + CQN ĐTĐ HFD ND Lơ chuột Hình Các số GOT GPT gan chuột Chỉ số men gan GOT, GPT biểu mức độ tổn thương tế bào gan, tế bào gan bị tổn thương giải phóng enzyme vào máu làm nồng độ chúng tăng lên Nồng độ GOT, GPT tăng tỷ lệ thuận với mức độ tổn thương tế bào gan Ở chuột bình thường GOT khoảng 23.4 (U/L), GPT 11.2 (U/L) so với chuột điều trị 22.4 (U/L) 25.2 (U/L), thấp nhiều so với chuột bị ĐTĐ 86.54 (U/L) 93.25 (U/L) Như chứng tỏ, dịch chiết chuối hột có tác dụng làm giảm nồng enzyme GOT, GPT máu gan chuột ĐTĐ Cao học khóa K17 52 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học 3.5.2 Hoạt độ số enzyme oxi hóa máu gan chuột Hoạt độ enzyme catalase Bảng Hoạt độ catalase máu gan chuột Các lô Catalase gan Tương đối(%) Catalase máu Tương đối(%) ND 0,019±0,008 100 0,017±0,001 100 ĐTĐ + NaCl 0.9% 0,011±0,003 57,89 0,014±0,0015 82,35 ĐTĐ + CQN 0,02±0,0015 105,26 0,019±0,0064 111,76 ĐTĐ + CQnH 0,025±0,002 131,58 0,022±0,003 129,41 140 % catalase 120 100 80 Tương đối Catalase gan (%) 60 40 Tương đối Catalase máu (%) 20 ND ĐTĐ + NaCl 0.9% ĐTĐ + CQN ĐTĐ + CQnH Lô chuột Hình Phần trăm tương đối catalase máu gan chuột Qua bảng biểu đồ ta nhận thấy hoạt độ enzyme catalase lô uống dịch chiết tăng nhẹ so với lô đối chứng tăng nhiều so với lô không điều trị Trong đó, lơ chuột uống chuối n-hexan tăng cao cụ thể gan (131.58%), máu (129.41%) chuối nước gan Cao học khóa K17 53 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học tăng (105.26%), máu (111.76%), so với chuột không uống dịch chiết 57.89% 82.35% Các số liệu bảng có ý nghĩa với độ tin cậy (p>0.05) Từ đó, khẳng định dịch chiết chuối hột có tác dụng làm tăng hoạt độ enzyme catalase máu gan chuột + Hoạt độ Cytocrome b5 Chúng tiến hành đánh giá hoạt độ enzyme cyt b5 máu gan chuột từ hai lô chuột cho uống dịch chiết chuối hột thu kết (Ccyt b5 = -0.0357±0.0005) Từ đó, kết luận dịch chiết chuối hột khơng có tác dụng làm tăng hoạt độ enzyme cyt b5 máu gan 3.6 Kết phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất Từ kết trên, sử dụng dịch chiết phân đoạn nhexan chuối hột để tiến hành phân lập cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel pha thuận pha đảo với hệ dung mơi thích hợp, thu kết sau: 3.6.1 Hợp chất Stigmast-5.22-dien-3- -ol (H3) Chúng tiến hành rửa giải cột hệ dung môi n-hexan - etyl axetat (30:1), thu khối chất rắn vô định hình, tách lặp lại cột silicagel kết tinh lại n-hexan thu tinh thể hình kim, khơng màu, có khối lượng 21mg, RfA= 0.64, nóng chảy 155-157C 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 36.5 (t, C-1); 29.21 (t, C-2); 71.81 (d, C-3); 42.32 (t, C-4); 140.78 (d, C-5); 121.70 (d, C-6); 37.28 (t, C-7); 31.93 (d, C-8); 51.24 (d, C-9); 36.52 (s, C-10); 24.36 (t, C-11); 42.32 (t, C-12); 31.68 (s, C13); 56.79 (d, C-14); 26.15 (t, C-15); 31.57 (t, C-16); 56.10 (d, C-17); 12.05 (q, C18); 19.38 (q, C-19); 40.45 (d, C-20); 21.05 (q, C-21); 138.29 (d, C-22); 129.32 (d, C-23); 50.17 (d, C-24); 33.98 (t, C-25); 21.09 (q, C-26), 19.80 (d, C-27); 29.21 Cao học khóa K17 54 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học (q, C-28); 12.22 (q, C-29) Chất kết tinh hình kim, khơng màu, khối lượng 21mg, nóng chảy 155-157oC có mặt dịch chiết hexan Trong phổ 13 C-NMR DEPT có mặt nhóm CH liên kết với hydroxyl C 71.82ppm proton liên kết với C-6 vị trí nối đơi có C-6 121.72ppm C-5 140.78ppm Ngoài phổ 13C-NMR chất có mặt CH nối đơi có tín hiệu C 138,29 129.32ppm đặc trưng cho cacbon (CH) vị trí C22-23 Các số liệu phổ 13 C-NMR hồn tồn phù hợp với phổ stigmast-5.22-dien-24R-3β-ol [7] Số liệu phổ chất trình bày bảng 3.6.2 Hợp chất  - Sitosterol Tiến hành rửa giải cột hệ dung môi n-hexan - etyl axetat (20:1), thu khối chất rắn vơ định hình, tách lặp lại cột silicagel kết tinh lại n-hexan thu tinh thể hình kim, khơng màu, có khối lượng 23mg, RfB=50, nóng chảy 135-136C H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0.68 (3H, s, Me-18); 1.01 (3H, s, 19-Me); cụm doublet  0.81 0.88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 Me27);0.83 (3H, t, 7.32Hz, Me-29); 0.92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3.52 (1H, m, H-3); 5.35 (1H, d, J 5Hz, H-6) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 140.8 (s, C-5); 121.7 (d, C-6); 71.8 (d, C-3); 56.8 (d, C-14); 56.1 (d, C-17); 50.2 (d, C-9); 45.9 (d, C-24); 42.3 (s, C-13); 42.3 (t, C-4); 39.8 (t, C-12); 37.3 (t, C-1); 36.5 (s, C-10); 36.2 (d, C-20); 33.9 (d, C-8); 31.9 (t, C-7); 31.7 (t, C-2); 29.2 (d, C-25); 28.3 (t, C-16); 26.2 (t, C23); 24.3 (t, C-15); 21.1 (t, C-11); 19.8 (q, C-26); 19.4 (q, C-19); 19.1 (q, C-27); 18.8 (q, C-21); 11.9 (q, C-29); 11.9 (q, C-18); 23.1 (t, C-28); 42.3 (t, C-4) Cao học khóa K17 55 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Chất H19 kết tinh lại hexan cho tinh thể hình kim, nóng chảy 135-136C Trong phổ 1H- 13 C-NMR có mặt nhóm hydroxyl H 3.53ppm (proton CH liên kết với OH), C 71.82ppm nối đôi H 5.35ppm (1H, d, J 5Hz) tín hiệu proton liên kết với C-6 vị trí nối đơi, C-5 140.78ppm, s C-6 121.72ppm, d), tín hiệu proton thuộc nhóm metyl (CH3) với H 1.02 (3H, s, 19Me), 0.95 (3H, d, J 10Hz, 21-Me), 0.86 (3H, d, J 7.7Hz, 27-Me), 0.84 (3H, d, J 7.7Hz, 26-Me), 0.82 (3H, t, J 7.32 Hz, 29-Me ) 0.69 (3H, s, 18-Me) Phổ 13 C-NMR cho biết có tổng số 29 cacbon, có cacbon bậc 4, nhóm metin (CH), 11 nhóm metylen (CH2), nhóm metyl (CH3) Mặt khác phổ khối EI-MS cho biết [M]+ 414amu Về tính chất vật lý điểm nóng chảy chất đem so sánh với mẫu chuẩn giá trị Rf mỏng thấy phù hợp Các liệu phổ NMR phù hợp với -sitosterol (xem bảng 9) 3.6.3 Hợp chất  - Sitosterol-glucopyranosit Tiếp tục rửa giải cột dung môi etylaxetat thu khối chất rắn vơ định hình, RfD=62, nóng chảy 269-270oC Phổ FT-IR max (cm-1): 3390 (rộng); 2934, 1644, 1464, 1461, 1373, 1073, 1026 Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H 12O6]+ Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6), ọ (ppm): 0.70 (3H, s, 18-Me), 0.93 (3H, s, 19-Me), 0.94 (3H, s, Me) Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), ọ (ppm) : 140.8 (s, C-5), 122.3 Cao học khóa K17 56 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học (d, C-6), 101.5 (d, C-1’), 79.5 (d, C-3), 76.9 (d, C-5’), 76.2 (d, C-3’), 74.0 (d, C-2’), 70.8 (d, C-4’), 62.3 (t, C-6’), 57.2 (d, C-14), 56.5 (d, C-17), 50.7 (d, C9), 46.4 (d, C-24), 42.7 (s, C-13), 40.2 (t, C-12), 39.1 (t, C-4), 37.6 (t, C-1), 37.1 (s, C-10), 36.4 (d, C-20), 34.4 (t, C-22), 32.3 (d, C-8), 32.2 (t, C-7), 29.9 (t, C-16), 29.7 (t, C-25), 28.5 (t, C-2), 26.7 (t, C-23), 24.6 (t, C-15), 23.5 (t, C28), 21.4 (t, C-11), 19.9 (q, C-19), 19.5 (q, C-21), 19.2 (q, C-26), 19.0 (q, C27), 12.1 (q, C-29), 12.0 (q, C-18) Phổ IR xác nhận có mặt liên kết đơi (1640cm-1, H-6 5.30ppm) hấp thụ nhiều nhóm hyđroxyl nằm vùng (3390 cm-1) Quan sát phổ 13 C-NMR DEPT thấy có 35 tín hiệu ngun tử cacbon, có có cacbon bậc 4, 14 nhóm metin (CH), 12 nhóm metylen (CH2), nhóm metyl (CH3) Đặc biệt phổ 13 C-NMR cho biết thấy có tín hiệu ngun tử cacbon gắn với oxy đặc trưng cho phần đường (nằm vùng 61.59 đến 100.92 ppm), có tín hiệu 140.14 121.80ppm thuộc liên kết olefin Ngồi có phổ 1H-NMR quan sát thấy proton phần đường xuất dạng doublet 4.32ppm, có J=7.8Hz C-1’ tương ứng 100.92 ppm Số liệu phổ IR, MS, 1H- 13C-NMR thu cho phép nghĩ đến cấu trúc hợp chất glucosid có cơng thức C35H60O6 Những điểm trình bày kết hợp so sánh điểm nóng chảy với sterol glucosid chuẩn cho phép khẳng định H20 -sitosterol-3-O--D-glucopyranosyl Phổ 1H 13C-NMR H20 so với phổ H19 cho thấy có khác vùng 61.59ppm đến 100.92ppm, tín hiệu khác lại gần giống so sánh bảng Cao học khóa K17 57 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Sau phân tích, chất có cấu trúc sau: 26 21 18 12 21 20 17 23 22 24 25 27 28 19 29 14 10 15 RO R (1) -sitosterol H (2) Stigmasterol H (3) -sitosterol-glucosid Gluc 22 Bảng Dữ liệu phổ chất STT -sitosterol (1) Stigmasterol (2) -sitosterolglucosid (3) 37.28 t 36.50 t 37.04 t 28.25 t 29.21 t 27.96 t 71.82 d 71.81 d 78.85 d 39.80 t 42.32 t 38.43 t 140.78 s 140.78 s 141,40 s 121.72 d 121.70 d 121.80 d 31.68 t 37.28 t 31.67 t 31.93 d 31.93 d 31.67 d 50.16 d 51.24 d 50.01 d 10 36.52 s 36.52 s 36.47 s Cao học khóa K17 58 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học 11 21.10 t 24.36 t 20.81 t 12 42.32 t 42.32 t 39.55 t 13 42.34 s 31.68 s 42.09 s 14 56.79 d 56.79 d 56.55 d 15 24.32 t 26.15 t 24.00 t 16 29.71 t 31.57 t 29.33 t 17 56.09 d 56.10 d 55.85 d 18 11.87 q 12.05 q 11.48 q 19 19.82 q 19.38 q 19.36 q 20 36.16 d 40.45 d 35.89 d 21 19.40 q 21,05 q 18.94 q 22 33.97 t 138.29 d 33.72 t 23 26.12 t 129.32 d 25.85 t 24 45.57 d 50.17 d 45.67 d 25 29.19 d 33,98 d 28.94 d 26 19.05 q 21.09 q 18.61 q 27 18.79 q 19.80 q 18.41 q 28 23.09 t 29.21 t 22.81 t 29 11.99 q 12.22 q 11.54 q 1' 100.92 d 2' 73.37 d 3' 75.70 d 4' 70.05 d 5' 76.31 d 6' 61.59 t Cao học khóa K17 59 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu khả hạ đường huyết dịch chiết phân đoạn phận chuối hột (quả củ) lên chuột gây ĐTĐ type 2, đạt số kết sau: Dịch chiết phân đoạn chuối hột có khả hạ đường huyết chuột ĐTĐ type ổn định dịch chiết phân đoạn củ chuối hột Trong dịch chiết chuối hột chứa hợp chất chủ yếu thuộc nhóm saponin, tanin, steroid glycorit Dịch chiết chuối hột có tác dụng làm tăng hoạt độ enzyme catalase, giảm nồng độ GOT, GPT, đồng thời làm tăng số cholesterol triglyxerit máu gan chuột ĐTĐ type Đã phân lập xác định cấu trúc chất dịch chiết phân đoạn n-hexan chuối hột -sitosterol; Stigmasterol; -sitosterolglucosid ĐỀ XUẤT Chúng xin đề xuất số ý kiến sau: Tiếp tục nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết dịch chiết thân chuối hột lên mơ hình chuột gây ĐTĐ type 2 Tiếp tục phân tích thành phần hóa học dịch chiết từ củ chuối hột hai phân đoạn ethylacetat, cồn chuối hột Ứng dụng kết nghiên cứu vào sản xuất thực phẩm chức hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ type Cao học khóa K17 60 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ môn Y học Cổ truyền dân tộc – Trường Đại học Y Hà Nội (1999), “Đái tháo đường”, Y học Cổ truyền, NXB Y học Nguyễn Văn Bàn (1996), Phân tích sàng lọc hóa thực vật Viện dược liệu Đàm Trung Bảo, Hà Tích Huyền, Hồng Văn Vinh (1999), Chất chống oxi hóa để phòng bệnh tật chống lão hóa NXB Y học, Hà Nội Trương Quốc Bảo, Hải Ngọc (1994), “Tiêu khát”, Chữa bệnh nội khoa y học cổ truyền, trang 121-125 Tạ Văn Bình (2006), Bệnh đái tháo đường – Tăng glucose máu, NXB Y học, Hà Nội Bộ mơn Hóa sinh, Học viện Qn y (2006), Thực tập Hóa sinh NXB Quân đội Nhân dân Hà Nội Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, Nguyễn Văn Đàn (1986), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2002), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội 10 Phùng Thanh Hương, Phạm Thị Thúy Hà, Nguyễn Xuân Thắng, Đỗ Ngọc Liên (2008), “Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng hạ glucose huyết dịch chiết lăng nước Lagerstroemia speciosa”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 11 Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzym, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 12 Phan Hải Nam (2004), Một số xét nghiệm hóa sinh lâm sàng, NXB Quân đội Nhân dân Hà Nội Cao học khóa K17 61 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học 13 Nguyễn Thị Thanh Ngân, “Nghiên cứu số hợp chất tự nhiên, đặc tính kháng khuẩn khả trị bệnh tiểu đường cấy khế (Averrhoa Carambola L.)”, Luận văn Thạc sỹ khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 14 Thái Hồng Quang (1985), Bệnh nội tiết, Học Viện Quân y, NXB Quân đội Nhân dân, Hà Nội 15 Phan Sỹ Quốc (1990), “Rối loạn Lipid máu người thừa cân béo phì”, Tạp chí y học thực hành, số 446, trang 31-40 16 Phạm Văn Thanh (2004), Nghiên cứu thuốc điều trị bệnh đái tháo đường từ mướp đắng (Momodica Charantia L Cucurbitaceae), Luận án Tiễn sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội 17 Nguyễn Thị Thanh Hải, Hà Thị Bích Ngọc, Nguyễn Văn Mùi (2008), “Đánh giá khả hạ đường huyết giảm béo phì dịch chiết thìa canh Gymnema sylvestre lên chuột gây đái tháo đường”, Kỷ yếu hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 640-644 18 Trịnh Thị Thu (2009), Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết dịch chiết dừa cạn (Catharanthus Roseus L.) xoài (Mangifera indica L) lên mơ hình chuột ĐTĐ type 2” Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 19 Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 20 Vũ Đình Vinh, Đặng Hanh Phúc, Đỗ Đình Hồ (1974), Kỹ thuật Y sinh hóa, Học viện Quân y, NXB Quân đội Nhân dân 21 Nguyễn Ngọc Xuân (2004), Nghiên cứu tác dụng hà đường huyết Thổ phục linh (Sminax glabra Roxb Smilacaceae) súc vật thực nghiệm Luận án tiễn sĩ Dược học, Đại học Y Hà Nội Cao học khóa K17 62 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Tài liệu Tiếng Anh 22 Amos A., McCarty D., Zimmet P (1997), “The rising global burden of diabetes and its complication: estimates and projections to the year 2010” Diabetes Med, Vol 14 pp 1-85 23 Bergmeyer S (1974), “Glucose6Phosphatase”, Methods of enzymatic analysis, NewYork, Vol 2, pp 788-92 24 Bourtney Hamish C., Olefsky Jerrold M (2007), “Insulin Resistance”, Mechanisms of Insulin Actions, Landes Bioscience and Springer Science+Business Media 25 Bessesen Daniel H (2001), “The role of carbohydrate in insulin resistance”, The Journal of nutrition, pp 2782-86 26 Deborah Podolin A., Wei Y., Pagliassotti Michael J (2005), “Effects of high fat diet and volumtary wheel running on gluconeogenesis and lipolysis in rats”, Journal of Applied Physiology, pp 1374-80 27 Dipalma J.R (1971), “Diabetes mellitus”, Drill's pharmacology in medicine, McGraw-Hill, pp 1492-1510 28 Gunitha I.S.R., Ranjendram K., Shiruwaikar A , Shirwaikar A (2005) “Alcoholic stem extract of Coscinium fenestratum regulates Carbohydrate Metabolism and improves antioxidant status in Streptozotocin Nicotinamide induced diabetic rats”, eCAM, pp 1-7 29 Gholap S, Kar A (2004 ), “Hypoglycaemic effects of some plant extracts are possibly mediated through inhibition in corticosteroid concentration”, Pharmazie, No 59(11), pp.876-8 30 Joseph G (2005), Assesment of anti-diabetic effect of Vietnamese herbal drugs, Doctor Thesis, Karolinska Institude, Stockholm, Sweden 31 Korhede Wizell M., Ahren B (2004), “The high fat diet-fed mouse A Cao học khóa K17 63 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type diabetes”, Diabetes, Vol 53, pp 215-9 32 Robert J., Joseph F., Jeffrey E (2001), “The potential mechanism of the diabetogenic action of streptozotocin: inhibition of pancreatic  -cell OGlucNAc-selective N-acetyl- -D-glucosaminidase” Biochem J., pp 31-41 33 Runnarsson R., Berne C., Hellerstrom C (1974), “Cytotoxic effects of Streptozotocin and N-Nitrosomethylurea on the pancreatic -cells with special regard to the role of Nicotinamide-Adenine Dinucleotide”, BiochemJ, No 182, pp 487-494 34 Rharmilee P Sawant, Ankur V Dnyanmote (2006), “Protective effect of type diabetes on Aceiaminopher induced hepatotoxicity in male SwissWebster mice”, Medicographia, Vol 24, No.4, pp 304 – 308 35 Shigemura N, Nakao K, Yasuo T, Murata Y, Yasumatsu K, Nakashima A, Katsukawa H, Sako N, Ninomiya Y (2008), “Gurmarin sensitivity of sweet taste responses is associated with co-expression patterns of T1r2, T1r3, and gustducin”, Biochem Biophys Res Commun, No 367(2), pp 356-63 36 Sudhesh K., Stephen O’ R (2007), Insulin Resistance, Willey Press 37 The World Health Report (1997), WHO, Switzelend 38 WHO expert committee (1980), Diabetes mellitus, 2th rep Geneva World Health Org 39 Yamada A., Nakamura Y., Sugita D., Shirosaki S., Ohkuri T., Katsukawa H., Nonaka K., Imoto T., Ninomiya Y (2006), “Induction of salivary kallikreins by the diet containing a sweet-suppressive peptide, gurmarin, in the rat” Biochem Biophys Res Commun, No 346(2), pp 386-92 Cao học khóa K17 64 Nguyễn Thị Duyên ... học khóa K17 24 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học 2. 2 Phương pháp nghiên cứu Trong trình nghiên cứu, tiến hành nghiên cứu theo hướng sau: Chuột ni béo phì Mẫu củ chuối hột khô nghiễn... [14, 18] Cao học khóa K17 22 Nguyễn Thị Duyên Luận văn Thạc sĩ khoa học Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1 Đối tượng nghiên cứu 2. 1.1 Mẫu thực vật Cây chuối hột thu hái Tân Yên – Bắc... axit Phản ứng tiến hành theo phương trình [11, 23 ]: H 2O2  H2O + O2 2KMnO + 5H2O2 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K 2SO4 + 8H2O + 5O2 Máu chuột lấy từ chuột ĐTĐ type sau 10 ngày cho uống dịch chiết thực vật