Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương

Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐOÀN HOÀNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƢỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐOÀN HOÀNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƢỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Đinh Văn Hân PGS TS Ngô Giang Liên Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Đinh Văn Hân PGS TS Ngô Giang Liên – người thầy tận tâm, nhiệt tình bảo, hướng dẫn động viên, cổ vũ tinh thần cho em suốt trình thực đề tài luận văn thạc sĩ Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo giảng dạy em năm qua, kiến thức mà em nhận giảng đường hành trang giúp em vững bước tương lai Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học Tế bào - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa học Xin chân thành cảm ơn cô chú, anh chị bạn đồng nghiệp Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị Bỏng – Viện Bỏng Quốc Gia quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất người thân yêu động viên, khích lệ, giúp đỡ em trình học tập để em hoàn thành luận văn này! Hà Nội, ngày 16 tháng 08 năm 2014 Học viên Đoàn Hoàng Thu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng Error! Bookmark not defined 1.2 Công nghệ mô – tế bào làm lành vết thƣơng Error! Bookmark not defined 1.2.1 Tổn thƣơng da nhu cầu chế tạo chế phẩm điều trị vết thƣơng Error! Bookmark not defined 1.2.2 Một số loại tế bào vật liệu điều trị vết thƣơng từ nuôi cấy tế bào Error! Bookmark not defined 1.3 Vai trò tế bào gốc liền vết thƣơng Error! Bookmark not defined 1.4 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Error! Bookmark not defined Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Đối tƣợng, nguyên - vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất cho nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.3 Trang thiết bị vật tƣ Error! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu: Error! Bookmark not defined 2.2.1 Thu mô mỡ phân lập tế bào Error! Bookmark not defined 2.2.2 Nhân rộng tế bào Error! Bookmark not defined 2.2.3 Xác định số lƣợng tế bào: Error! Bookmark not defined 2.2.4 Xác định khả tạo dòng (colony) tế bàoError! Bookmark not defined 2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng tế bào gốc mô mỡ đến tế bào da nuôi cấy Error! Bookmark not defined 2.2.5.1 Đánh giá ảnh hƣởng tế bào gốc mô mỡ đến tăng sinh nguyên bào sợi Error! Bookmark not defined 2.2.5.2 Đánh giá ảnh hƣởng tế bào gốc mô mỡ lên khả di cƣ nguyên bào sợi Error! Bookmark not defined 2.2.5.3 Đánh giá ảnh hƣởng tế bào gốc mỡ đến tăng sinh tế bào sừng Error! Bookmark not defined 2.2.5.4 Đánh giá ảnh hƣởng tế bào gốc mỡ đến di cƣ tế bào sừng Error! Bookmark not defined 2.2.6 Phƣơng pháp chế tạo tế bào gốc mỡ cho thí nghiệm đồng nuôi cấy Error! Bookmark not defined Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 3.1 Đặc điểm phân lập hình thái tế bào Error! Bookmark not defined 3.2 Khả tạo dòng tế bào (CFU-F) Error! Bookmark not defined 3.3 Ảnh hƣởng tế bào gốc mỡ lên tăng sinh di cƣ tế bào da qua thí nghiệm đồng nuôi cấy Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tác động tế bào gốc mỡ đến nguyên bào sợiError! Bookmark not defined 3.3.2 Tác động tế bào gốc mỡ đến tế bào sừngError! Bookmark not defined BÀN LUẬN Error! Bookmark not defined 4.1 Về đặc điểm tế bào phân lập Error! Bookmark not defined 4.2 Tinh lọc tế bào, đặc điểm hình thái khả tạo colony Error! Bookmark not defined 4.3 Ảnh hƣởng tế bào gốc mỡ lên tế bào da nuôi cấy Error! Bookmark not defined 4.3.1 Ảnh hƣởng tế bào gốc tới nguyên bào sợi daError! Bookmark not defined 4.3.2 Ảnh hƣởng tế bào gốc mô mỡ đến tế bào sừngError! Bookmark not defined 4.4 Chế phẩm tế bào gốc giá đỡ Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ 60 DANH MỤC BẢNG Bảng Khả tạo dòng tế bào tách từ mô mỡ (n=5) Error! Bookmark not defined Bảng Khả tạo CFU-F theo hệ tế bào (n=5)Error! Bookmark not defined Bảng Ảnh hƣởng tế bào gốc đến tăng sinh nguyên bào sợiError! Bookmark not defined Bảng Thời điểm nguyên bào sợi gia tăng số lƣợng có tế bào gốc Error! Bookmark not defined Bảng Tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau trypsinError! Bookmark not defined Bảng Ảnh hƣởng tế bào gốc đến tăng sinh tế bào sừngError! Bookmark not defined Bảng Ảnh hƣởng tế bào gốc tới di cƣ tế bào sừngError! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH Hình Sơ đồ tăng sinh nguyên bào sợi giai đoạn khác trình liền vết thƣơng Error! Bookmark not defined Hình Mô thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng tế bào gốc mô mỡ phƣơng pháp đồng nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình Tạo vết thƣơng in vitro Error! Bookmark not defined Hình Tách mô mỡ enzym collagenase Error! Bookmark not defined Hình Đĩa tế bào sau 48h nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình Tế bào sau 10 ngày nuôi cấy Error! Bookmark not defined Hình Tế bào gốc mỡ kính hiển vi đảo ngƣợc 50X(A) 100X(B) Error! Bookmark not defined Hình Hình thái tế bào gốc mỡ sau nhuộm Giemsa (100X)Error! Bookmark not defined Hình Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ (50X)Error! Bookmark not defined Hình 10 Tế bào gốc mỡ tạo colony ngày thứ 10 20 (50X)Error! Bookmark not defined Hình 11 Các đĩa colony sau nhuộm giemsa Error! Bookmark not defined Hình 12 Biểu đồ so sánh số lƣợng tế bào thu đƣợc thí nghiệm đồng nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi ngày thứ 2.Error! Bookmark not defined Hình 13 Tác động tế bào gốc mô mỡ lên tăng sinh nguyên bào sợi (50X) Error! Bookmark not defined Hình 14 Sự gia tăng số lƣợng nguyên bào sợi theo thời gian.Error! Bookmark not defined Hình 15 So sánh số lƣợng tế bào thu đƣợc thí nghiệm đồng nuôi cấy tế bào gốc với tế bào sừng Error! Bookmark not defined Hình 16 Tác động tế bào gốc mô mỡ lên tăng sinh tế bào sừng Error! Bookmark not defined Hình 17 Tế bào sừng độ che phủ đạt 100 , tế bào sừng hình ovan đa diện mọc dày xếp khít trƣớc tạo vết cạo để đồng nuôi cấy với tế bào gốc mỡ nguyên bào sợi (50X) Error! Bookmark not defined Hình 18 Ảnh hƣởng tế bào gốc mỡ lên di cƣ biệt hóa tế bào sừng (50X) Error! Bookmark not defined Hình 19 So sánh hình thái tế bào gốc mô mỡ…………………………….Error! Bookmark not defined DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AB Antibiotic/Antimycotic - Kháng sinh ADSCs Adipose-Derived Stem Cells - Tế bào gốc mỡ DMEM Dubeco‘s Modified Eagle Medium EGF Epidermal Growth Factor - Yếu tố tăng trƣởng biểu bì FBS Fetal Bovine Serum - Huyết bào thai bê FGF Fibroblasts Growth Factor - Yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi HGF Hepatocyte Growth Factor IL Interleukin ITS-X Insulin, Transferin, Selen - X KGF Keratinocyte Growth Factor - Yếu tố tăng trƣởng tế bào sừng MCS Mesenchymal stem cells - Tế bào gốc trung mô P Passage- Cấy chuyển PBS Phosphat Buffer Saline - Dung dịch đệm phosphat PDGF Pletelet-Derived Growth Factor TB Tế bào TGF Transforming Growth Factor VEGF Vessle Endothelial Growth Factor ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc lĩnh vực sinh học lôi Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đƣợc y học giới lựa chọn nhƣ liệu pháp hữu hiệu để chữa khỏi số bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy, xƣơng khớp…Trên giới, có số nguồn tế bào gốc đƣợc đƣa vào ứng dụng nhƣ tế bào gốc tủy xƣơng tế bào gốc máu cuống rốn, tế bào gốc từ nguồn chủ yếu tế bào gốc tạo máu nên đƣợc ứng dụng nghiên cứu điều trị bệnh máu, bệnh cần có tái tạo thuộc hệ thống trung mô đƣợc ứng dụng Trong đó, bệnh trung mô lại thƣờng gặp nhƣ vết thƣơng, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim…Một nguồn TB gốc khác đƣợc kỳ vọng nhiều tế bào gốc phôi, có tiềm lớn nhƣng việc nghiên cứu sử dụng khó khăn công nghệ đặc biệt bị cản trở vấn đề y đức (sử dụng tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc hủy phôi vốn trở thành ngƣời) Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác tế bào gốc từ phần phụ thai nhƣ bánh rau, dây rốn Thành công công nghệ tách nhân lên tế bào gốc nhƣng có bệnh nhân có bảo quản dây rốn – bánh rau…khi sinh có hy vọng đƣợc dùng nguồn tế bào gốc Hiện nay, có số lƣợng ngƣời đƣợc lƣu giữ dây rốn hay bánh rau sau sinh ra, đồng thời chi phí tốn xác suất ngƣời lƣu trữ mô lại có bệnh cần đƣợc điều trị tế bào gốc cao Tế bào gốc mỡ quần thể tế bào vạn năng, chúng biệt hóa thành nhiều dòng khác Mô mỡ loại mô có sẵn với số lƣợng lớn dễ dàng thu hồi nên nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo tƣơng lai sử dụng để ghép tự thân đặc biệt không gặp phải vấn đề y đức Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thƣơng thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ dạng tế bào quan trọng di cƣ đến vùng tổn thƣơng để thực nhiều khâu pha tăng sinh trình liền vết thƣơng 4.4 Chế phẩm tế bào gốc giá đỡ Thực tế, tế bào gốc mỡ chức tế bào đầu dòng cho việc tái sinh mỡ in vivo mà có khả sử dụng cho nhiều mục đích khác Giá đỡ chuyên biệt hệ thống tín hiệu cảm ứng cốt lõi cho việc biệt hóa tế bào gốc thành tế bào khác tùy theo yêu cầu mục đích sử dụng Với mục đích giải tổn khuyết mô mỡ cần giá đỡ chiều để nuôi cấy tế bào gốc mỡ Những vi chuỗi hạt collagen giá đỡ thích hợp cho tế bào gốc mỡ cho phép chúng có khả tăng sinh ex vivo biệt hóa từ mô có kích thƣớc đủ nhỏ để tiêm đƣợc [64] Ngƣời ta chứng minh mô mỡ tạo từ công nghệ mô với tế bào gốc mỡ giá đỡ collagen typ I đƣợc sử dụng cho việc điều trị tổn khuyết mô [49] Điều đƣợc khẳng định nghiên cứu khác gần đây, tế bào gốc mỡ có khả dính, tăng trƣởng tăng sinh tốt giá đỡ collagen typ I vốn nguyên liệu có biểu tính tƣơng hợp tế bào tuyệt vời đƣợc sử dụng nhƣ tá dƣợc công nghệ mô [83] Việc nuôi cấy in vitro tế bào gốc mỡ đệm màng ối loại bỏ tế bào giá đỡ acid hyaluronic liên kết chéo đƣợc mô tả Các tế bào kết dính đệm màng ối đƣợc thúc đẩy khả tăng sinh khả sống, khí đó, tế bào không kết dính gel acid hyaluronic liên kết chéo lại tăng khả biệt hóa [29], [30] Altman cộng mô tả cách nuôi cấy tế bào gốc mỡ giá đỡ Fibril Chitosan cho thấy tế bào gốc mỡ ngƣời cấy dạng giá đỡ có tác dụng thúc đẩy trình liền vết thƣơng chúng tăng biệt hóa thành nguyên bào sợi, tế bào nội mô tế bào biểu mô mô đƣợc khôi phục [16] Trong nghiên cứu trƣớc đây, cách sử dụng tế bào da tạo thành tế bào mà tế bào có liên kết với tạo thành tế bào với hỗ trợ loại giá đỡ khác Với cách thức này, tế bào có đặc tính ổn định khả sống phân chia nhƣ chúng môi trƣờng nuôi cấy labo Trong điều kiện đó, tế bào đƣợc ghép lên vết thƣơng chúng vừa có khả thực chức liền vết thƣơng vừa có khả che phủ bảo vệ vết thƣơng Cách thức thuận lợi cho ngƣời thực thao tác kỹ thuật chúng đƣợc ghép vết thƣơng nhƣ ghép da thông thƣờng Đối với nghiên cứu này, thiết kế nghiên cứu cấy tế bào số loại giá đỡ polymer để xác định khả tế bào gốc trung mô phát triển tốt nhằm tạo tế bào phục vụ ghép vết thƣơng Đề tài nghiên cứu trƣớc chế tạo thành công nguyên bào sợi cách cấy nguyên bào sợi nuôi cấy lớp màng vật liệu che phủ vết thƣơng có chất polyurethan [6] Tuy nhiên loại tế bào khác khả bám sống chúng loại vật liệu khác Với thiết kế nghiên cứu truyền thống nghiên cứu đặc tính nuôi cấy tế bào trung mô, tiến hành thí nghiệm nhiều loại vật liệu khác nhận thấy vật liệu có chất polyurethan (tegaderm) vật liệu polymer có tráng collagen cho phép tế bào nuôi cấy bám phát triển Chúng thí nghiệm xác định khả bám, phát triển tế bào transwell Transwell loại đĩa nuôi cấy tế bào có sẵn lớp màng dễ dàng tách khỏi đĩa nuôi cấy Lớp màng có vi lỗ cho phép trao đổi dinh dƣỡng nhƣng không cho phép tế bào chui qua, với đặc tính lớp màng có khả che phủ vết thƣơng Quan sát dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc thấy tế bào gốc trung mô nuôi cấy đĩa transwell có thời gian để tế bào bám sống sau cấy nhanh có thời gian tồn đĩa lâu Chúng thí nghiệm đến ngày thứ tế bào đĩa transwell bám tốt Thí nghiệm đƣợc tiếp tục nhiều ngày thấy khả sống phát triển tế bào tốt tới ngày thứ 10-15 sau cấy Thông thƣờng tế bào gốc trung mô phát triển đạt 100 chồng lớp lên nhau, khả tăng sinh phát triển tế bào gốc tƣợng biệt hóa xảy Để đảm bảo tế bào gốc mỡ tình trạng chƣa biệt hóa có tốc độ nhân lên giữ nguyên, chế tạo tế bào với mật độ phủ kín bề mặt nuôi cấy 90 Số lƣợng tế bào đạt 90 đƣợc xác định là: 5,3 ± 1,2 x 104/cm2 độ che phủ KẾT LUẬN Qua nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hƣởng chúng đến tế bào da nuôi cấy định hƣớng điều trị vết thƣơng Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị bỏng -Viện Bỏng Quốc Gia, thu đƣợc kết rút kết luận sau: Chúng phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ - Số lƣợng tế bào phân lập đƣợc đạt 2,46 ± 1,4x106TB/gram mô - Các tế bào có khả tạo colony, colony tế bào gốc mô mỡ thuộc dạng CFU-F Tỷ lệ tạo CFU-F tế bào phân lập đƣợc 14,6 Sau tinh lọc tế bào đến p5, tỷ lệ tạo CFU-F 17,3% Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ có ảnh hƣởng tích cực tới tế bào da nuôi cấy - Tế bào gốc mô mỡ làm tăng sinh nguyên bào sợi da nuôi cấy Ngày thứ đồng nuôi cấy TBG mô mỡ với nguyên bào sợi da số lƣợng NBS thu đƣợc 6,8±0,5x104 tế bào/giếng 10cm2 Trong lô chứng TBG mô mỡ đồng nuôi cấy, số lƣợng NBS thu đƣợc từ 4.6±0,6 – 5,5±0,9x104 tb/giếng 10cm2 - Tế bào gốc mô mỡ không làm tăng sinh tế bào sừng nhƣng có tác động tăng di cƣ biệt hóa tế bào sừng điều kiện nuôi cấy Ngày thứ 5, tỷ lệ liền vết cạo đồng nuôi cấy TBG mô mỡ với tế bào sừng 98,1±4,5% Nhƣng lô chứng TBG mô mỡ tỷ lệ tiền vết cạo đạt 75,0±12,4% - Tác động tích cực tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đến tế bào da nuôi cấy thông qua khả sống tế bào gốc yếu tố ngoại bào KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu cấy ghép TB gốc mỡ điều trị vết thƣơng, vết bỏng Tiếp tục nghiên cứu để chế tạo sinh phẩm từ TB gốc ứng dụng điều trị vết thƣơng, vết bỏng TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Trịnh Bình, Phạm Phan Địch, Đỗ Kính (2002), Mô học, Nhà xuất y học, Hà Nội Phùng Quốc Đại, Phạm Mạnh Hùng (1997), ―Sự thay đổi globulin miễn dịch bệnh nhân bỏng‖, Thông tin bỏng, 2, tr 27-28 Trần Văn Hanh (1997), ―Quan điểm mô học đại trình liền vết thƣơng‖, Tài liệu đào tạo sau đại học – chuyên đề mô học, Đại học Y Hà Nội, tr 141-156 Đinh Văn Hân, Nguyễn Thị Hƣơng (2014), ―Nghiên cứu chế tạo hỗn dịch tế bào da tự thân không qua nuôi cấy dể điều trị vết thƣơng vết bỏng‖, Tạp chí y học thảm học & Bỏng, 3, tr 40 - 48 Đinh Văn Hân, Trần Ngọc Diệp, Nguyễn Tiến Dũng (2013) ―Đánh giá tác dụng dung dịch chiết nguyên bào sợi da nuôi cấy điều trị vết thƣơng mạn tính‖, Tạp chí y học thảm hoạ & Bỏng, 2, tr 47 – 54 Nguyễn Văn Huệ, Đinh Văn Hân CS (2006), Hợp tác nghiên cứu áp dụng công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi điều trị vết thương vết bỏng, Đề tài cấp nhà nƣớc Nghị định thƣ hợp tác với Liên Bang Nga Nguyễn Văn Huệ, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Hải An (2000), ―Nhận xét giảm bạch cầu máu ngoại vi trẻ em bỏng nặng‖, Tạp chí thông tin y dược, 10, tr 92-96 Nguyễn Viết Lƣợng (2009), ―Tình hình bỏng Việt Nam năm 2005 -2007‖, Tạp chí y học thảm hoạ & bỏng, 1, tr 26 Phạm Quang Ngọc (1990), ―Màng ối đƣợc đông khô diệt khuẩn tia gama dùng làm băng sinh học để điều trị vết bỏng‖, Tạp chí Y học thực hành, (2)285, tr 23 10 Phạm Đình Phú (1994), ―Ghép da đồng loại lần góp phần cứu sống bệnh nhân bỏng sâu diện rộng‖, Thông tin bỏng, 2, tr 17 11 Nguyễn Hữu Phùng, Dƣơng Ngọc (1994), ―Sử dụng da ếch màng ối đông khô điều trị bỏng nặng‖, Thông tin bỏng, 2, tr 15-16 12 Đỗ Quang, Đỗ Quang Hùng (1995), ―Sử dụng lâm sàng màng ối đơn ngƣời làm băng sinh học chữa bỏng bệnh da‖, Thông tin bỏng, 1, tr 16-18 13 Lê Thế Trung (2003), Bỏng kiến thức chuyên ngành, NXB Y Học 14 Trần Ngọc Tuấn, Đặng Tất Hùng (1996), ―Ứng dụng ghép da mắt lƣới kết hợp da tự thân với da dị loại bệnh nhân bỏng sâu diện rộng‖, Thông tin bỏng, 3, tr 17-20 B Tiếng Anh 15 Akino K, Mineda T, Akita S (2005), ―Early cellular changes of human mesenchymal stem cells and their interaction with other cells‖, Wound Repair Regen, 13, pp 434–440 16 Altman AM, Yan Y, Matthias N, et al (2008) IFATS Series: ―human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model‖, Stem Cells 17 Alvarez-Diaz C, Cuenca-Pardo J, Sossa-Serrano A (2000), ―Burns treated with frozen cultured human allogeneic epidermal sheets‖, J Burn Care Rehabil, 21, pp 291–299 18 Armour A, Scott P.G, Tredget E.E, (2007), ―Cellular and molecular pathology of HTS: basis for treatment, Wound Repair Regen, 15 (Suppl 1), S6–S17 19 Ayyappan T, Chadha A, Shaikh MF et al (2004) ―Topically applied autologous bone marrow in healing of chronic non-healing raw areas-a pilot study‖, Indian J Burns 2004, 12, pp 42-7 20 Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko M.S, Brem H, Tomic-Canic M (2008), ―Growth factors and cytokines in wound healing‖, Wound Repair Regen, 16, pp 585–601 21 Brem H, Golinko MS, Stojadinovic O et al (2008), ―Primary cultured fibroblasts derived from patients with chronic wounds: a methodology to produce human cell lines and test putative growth factor therapy such as GMCSF‖, Journal of Translational Medicine 75(6) 22 Chen L, Tredget E.E, Wu P.Y, Wu Y (2008), ―Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing‖, PLoS ONE 3, e1886 23 Clark Richard A.F (1993), ―Basic of cutaneous wound repaire‖, J Dermatol surg Oncol, 19(12), pp 116-122 24 Cohen I.K, Diegelman R.F, Crossland M.C, (1994), Wound care and wound healing, Sprnciples of Surgery, 1, pp 279-304 25 Diegelmann R.F, Evans M.C (2004), ―Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing‖, Front Biosci, 9, pp 283–289 26 Falanga V, Iwamoto S, Chartier M, Yufit T, Butmarc J, Kouttab N, Shrayer D, Carson P (2007), ―Autologous bone marrow-derived cultured mesenchymal stem cells delivered in a fibrin spray cceleratehealing in murine and human cutaneous wounds, Tissue Eng‖, 13, pp 1299–1312 27 Falkenberg F.W, Weichert M, Krane H, Bartels I, Palme M, Nagels H.O, Fiebig H (1995), ―In vitro production of monoclonal antibodies in high concentration in a new and easy to handle modular minifermenter‖, J Immunol Meth, 179, pp 13–29 28 Fitzpatrick RE, Rostan EF (2003), ―Reversal of photodamage with topical growth factors: a pilot study‖, J Cosmet Laser Ther, 5, pp 25—34 29 Flynn LE, Prestwich GD, Semple JL, et al (2007) ―Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adiposederived stem cells‖, Biomaterials 2007, (28), pp 34-42 30 Flynn LE, Prestwich GD, Semple JL, et al (4/2008) ―Proliferation and differentiation of adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds‖, Biomaterials, (29), pp 1862-71 31 Friedenstein A.J, Chailakhyan R.K, Latsinik N.V, Panasyuk A.F (1974) ―Keiliss-Borok, Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues Cloning in vitro and retransplantation in vivo‖, Transplantation, 17, pp 331–340 32 Han S.K, Yoon T.H, Lee D.G et al (2005) ―Potential of human bone marrow stromal cells to accelerate wound healing in vitro‖, Ann Plast Surg 2005, 55, pp 41-49 33 Hansbrough JF, Mozingo DW, Kealey GP, Davis M, Gidner A, Gentzkow GD (1997), ―Clinical trials of a biosynthetic temporary skin replacement, Dermagraft- Transitional Covering, compared with cryopreserved human cadaver skin for temporary coverage of excised burn wounds", J Burn Care Rehabi 1997 Jan-Feb, 18 (1 Pt1), pp 43-51 34 Hehenberger K, Kratz G, Hansson A, Brismar K (1998), ―Fibroblasts derived from human chronic diabetic wounds have a decreased proliferation rate, which is recovered by the addition of heparin‖, J Dermatol Sci, 16, pp 144–151 35 Herndon D.N, Barrow R.E, Rutan R.L, Rutan T.C, Desai M.H, Abston S (1989), ―A comparison of conservative versus early excision Therapies in severely burned patients‖, Ann Surg, 209, pp 547–5528 discussion 552–543 36 Hu R, Ling W, Xu W, Han D (2014), ―Fibroblast-Like Cells Differentiated from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells for Vocal Fold Wound Healing‖, PLoS ONE 9(3): e92676 37 Humpert PM, Bastsch U et al (2005), ―Locally applied mononuclesr bone marrow cells restore angiogenesis and promote wound healing in a type fiabetic patient‖, Exp Clin Endocrinol Diabetes 2005, 113, pp 538-40 38 Hunt T.K (1990), ―Basic principles of wound healing‖, J Trauma ,30(12), pp 122-128 39 Hyoju Kim, Kyuseok Choi, Oh-Kyeong Kweon, Wan Hee Kim (2012), ―Enhanced wound healing effect of canine adipose-derived mesenchymal stem cells with low-level laser therapy in athymic mice‖, Journal of Dermatological Science, 68, pp 149–156 40 John F Hasbrough, Hans Oliver Rennekampff (1998), ―Cultured skin cell for wound closure and for promoting wound healing Growth factor and wound healing basic science and potential clinical application‖, Serono Symposia USA Norwell, Massachusetts, pp 37-55 41 Jurgens WJ, Oedayrajsingh-Varma MJ, Helder MN, et al (6/2008), ―Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies‖, Cell Tissue Res, (26), pp 332:415 42 Khachemoune A, Bello Y.M, Phillips T.J (2002), ―Factors that influence healing in chronic venous ulcers treated with cryopreserved human epidermal cultures‖, Dermatol Surg, 28, pp 274–280 43 Kim W.S, Lee JJ, Jung DY, Jeon J, Heo HS, Kang HC, et al (2006), ―Profiling of differentially expressed genes in human stem cells by cDNA microarray‖, Mol Cells, 21, pp 343—55 44 Kiristy CP, Lynch AB, Lynch SE (1993), ―Role of growth factors in cutaneuos wound healing: a review‖, Crit Rev Oral Bio Med, 4, pp 729-760 45 Lauffenburger D.A, Horwitz A.F (1996), ―Cell migration: a physically integrated molecular process‖, Cell, 84, pp 359–369 46 Lerman O.Z, Galiano R.D, Armour M, Levine J.P, Gurtner G.C (2003), ―Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast: impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia‖, Am J Pathol, 162, pp 303–312 47 Li Y, Fan J, Chen M, Li W, Woodley D.T (2006), ―Transforming growth factor-alpha: a major human serum factor that promotes human keratinocyte migration‖, J Invest Dermatol, 126, pp 2096–2105 48 Loots M.A, Lamme E.N, Mekkes J.R, Bos J.D, Middelkoop E (1999), ―Cultured fibroblasts from chronic diabetic wounds on the lower extremity (non-insulin-dependent diabetes mellitus) show disturbed proliferation‖, Arch Dermatol Res, 291, pp 93–99 49 Lu F, Gao JH, Ogawa R, et al (2006 Dec), ―Adipose tissues differentiated by adipose-derived stem cells harvested from transgenic mice‖, Chin J Traumatol, 9, pp 359-64 50 MacNeil S (2007), ―Progress and opportunities for tissue-engineered skin‖, Nature 445, pp 874–880 51 Martin M.J et al (2005), ―Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid‖, Nat Med, 11(2), pp 228-32 52 Masakazu Ishii, Chika Koike et al (2005), ―Molecular markers distinguish bone marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts‖, Biochemical and Biophysical Research Communications, 332, pp 297–303 53 McFarlin K, Gao X, Liu Y.B, Dulchavsky D.S, Kwon D, Arbab A.S, Bansal M, Li Y, Chopp M, Dulchavsky S.A, Gautam S.C (2006), ―Bone marrowderived mesenchymal stem cells accelerate wound healing in the rat‖, Wound Repair Regen, 14, pp 471–478 54 Midwood K.S, Williams L.V, Schwarzbauer J.E (2004), ―Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix‖, Int J Biochem Cell Biol, 36, pp 1031–1037 55 Papini R (2004), ―Management of burn injuries of various depths‖, BMJ 329, pp 158–160 56 Pereira R.F, Halford K.W, O‘Hara M.D, Leeper D.B, Sokolov B.P, Pollard M.D, Bagasra O, Prockop D.J (1995), ―Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice‖, Proc Natl Acad Sci USA, 92, pp 4857–4861 57 Phan TT, et al (2005), ―Evaluation of cell culture on the polyurethane-based membrane (Tegaderm): implication for tissue engineering of skin‖, Cell Tissue Bank, 6(2), pp 91-7 58 Phinney D.G, Prockop D.J (2007), ―Mesenchymal stem/multipotent stromal cells; the state of transdifferentiation and modes of tissue repair — current views‖, Stem Cells, 25, pp 2896–2902 59 Ponec M (2002), ―Skin constructs for replacement of skin tissues for in vitro testing‖, Adv.Drug Deliv Rev, 54 (Suppl 1), S19–S30 60 Postlethwaite A.E, Keski-Oja J, Moses H.L, Kang A.H (1987), ―Stimulation of the chemotactic migration of human fibroblasts by transforming growth factor beta‖, J Exp Med, 165, pp 251–256 61 Purdue G.F, et al (1997), ―A Multi-center Clinical Trial of a Biosynthetic Skin Replacement, Dermagraft-TC, Compared with Cryopreserved Human Cadaver Skin for Temporary Coverage of Excised Burn Wounds‖, Journal of Burn Care and Rehabilitation, 18(1), 52-57 62 Reckhenrich A.K, Kirsch B.M, Wahl E.A, Schenck T.L, Rezaeian F, et al (2014), ―Surgical Sutures Filled with Adipose-Derived Stem Cells Promote Wound Healing‖, PLoS ONE 9(3): e91169 63 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, et al (2004) ―Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells‖, Circulation, 109, 1292—8 64 Rubin JP, Bennett JM, Doctor JS, et al (2007 Aug), Plast Reconstr Surg, 120:414-24 65 Sasaki M, Abe R, Fuita Y, Ando S, Inokuma D, Shimizu H (2008), ―Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type‖, J Immunol, 180, pp 2581–2587 66 Schade R, Pfister C, Halatsch R, Henklein P (1991), ―Polyclonal IgY Antibodies from Chicken Egg Yolk—An Alternative to the Production of Mammalian IgG type Antibodies in Rabbits‖, Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments, ATLA, Nottingham, pp 403–419 67 Schaffer CJ, Narrey LB (1996), ―Cell biology of wound healing‖, Int Rev Cytol, 169, pp 151-181 68 Seibold J.R, Uitto J, Dorwart B.B, Prockop D.J (1985), ―Collagen synthesis and collagenase activity in dermal fibroblasts from patients with diabetes and digital sclerosis‖, J Lab Clin Med, 105, pp 664–667 69 Sheng-Ping Huang, Chun-Hsiang Huang, Jia-Fwu Shyu, Herng-Sheng Lee4, Shyi-Gen Chen, James Yi-Hsin Chan and Shih-Ming Huang (2013), ―Promotion of wound healing using adipose-derived stem cells in radiation ulcer of a rat model‖, Journal of Biomedical Science, pp 20-51 70 Sheridan R.L, Tompkins R.G (1999), ―Skin substitutes in burns‖, Burns 25, pp 97-103 71 Smith A.N, Willis E, Chan V.T, Muffley L.A, Isik F.F, Gibran N.S, Hocking A.M (2010), ―Mesenchymal stem cells induce dermal fibroblast responses to injury‖, Exp Cell Res, 316, pp 48–54 72 Supp D.M, Boyce S.T (2005), ―Engineered skin substitutes: practices and potentials‖, Clin Dermatol, 23, pp 403–412 73 Togel F, Weiss K, Yang Y, Hu Z, Zhang P, Westenfelder C (2007), ―Vasculotropic, paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury‖, Am J Physiol Renal Physiol , (292), F1626–F1635 74 Vacanti C.A, Mikos A.G (1995), Tissue Eng, 1, pp 1–2 75 Valbonesi M, Giannini G, et al (2004), ―Cord blood (CB) stem cells for wound repaire‖, Transfus Apher Sci 2004, 30:153-6 76 Wahl LM, Wahl SM (1992), Inflamation In: Cohen IK, Diegelmann RF, Lindblad WJ, et all Wound Healing Biochemical and Clinical Aspects, Philadelphia, PA: WB Saunders Company, pp 40-60 77 Wainwright D.J (1995), ―Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns‖, Burns, 21, pp 243– 248 78 Wall S.J, Sampson M.J, Levell N, Murphy G (2003), ―Elevated matrix metalloproteinase-2 and -3 production from human diabetic dermal fibroblasts‖, Br J Dermatol, 149, pp 13–16 79 Werner S, Richard G (2003), ―Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines‖, Physiol Re, 83, pp 835-870 80 Woodley D.T, Peterson H.D, Herzog S.R, Stricklin G.P, Burgeson R.E, Briggaman R.A, Cronce D.J, O'Keefe E.J (1988), ―Burnwounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils‖, JAMA, 259, pp 2566–2571 81 Won-Serk Kim, Byung-Soon Park, Jong-Hyuk Sung, Jun-Mo Yang, SeokBeom Park, Sahng-June Kwak, Jeong-Soo Park (2007), ―Wound healing effect of adipose-derived stem cells: A critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts‖ Journal of Dermatological Science, 48, pp 15— 24 82 Wu Y, Chen L, Scott P.G, Tredget E.E (2007), ―Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis‖, Stem Cells, 25, pp 2648–2659 83 Zhang YS, Gao JH, Lu F, et al (2007 Feb), ‗‗Cellular compatibility of type collagen I scaffold and human adipose-derived stem cells‖, Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 27:223-5 84 Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, et al (2002), ―Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells‖, Mol Biol Cell, 13:4279—95 85 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, et al (2001), ―Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies‖, Tissue Eng, 7:211—28 [...]... bỏng điều trị thì nhu cầu về ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương nhằm mục tiêu sau: 1 Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều. .. là tế bào gốc mô mỡ lại dễ phân lập và có khả năng tăng sinh mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô tủy xƣơng Do đó, tế bào gốc mô mỡ có nhiều hy vọng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sửa chữa và tái tạo mô Khám phá vai trò của tế bào gốc mô mỡ đối với liền vết thƣơng da, chúng tôi khảo sát liệu tế bào gốc mô mỡ và sự tƣơng tác qua tiếp xúc tế bào giữa tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi da và tế bào sừng của. .. giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ bằng phương pháp đồng nuôi cấy Tế bào gốc mô mỡ đƣợc cấy trên insert chứa màng polycarbonate của đĩa transwell, màng polycarbonate có kích thƣớc lỗ là 0,45micromet và đƣợc tráng collagen, nguyên bào sợi và tế bào sừng đƣợc cấy ở khoang phía dƣới Ảnh hƣởng của tấm tế bào gốc mỡ đến hai loại tế bào da nuôi cấy này đƣợc đánh giá qua sự tăng sinh tế bào da và khả năng. .. EDGS Tế bào sừng đƣợc cấy trong 3 ngày trƣớc khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh Tế bào gốc mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm2 và duy trì trong môi trƣờng tăng sinh tế bào gốc trung mô nhƣ trên trong 5 ngày trƣớc khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80 -90 độ che phủ Tấm tế bào gốc mỡ cả insert sau đó đƣợc đặt vào các giếng tế bào sừng và bổ sung ngập trong môi trƣờng nuôi. .. mô mỡ Tế bào gốc mô mỡ đƣợc xác định là tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung mô lần đầu tiên đƣợc mô tả là dạng tế bào từ tủy xƣơng có khả năng tạo dòng, bám dính bề mặt nuôi cấy [31] mà có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào sụn và tế bào xƣơng [56] Sau đó , chúng đƣợc xác định là có mặt ở rất nhiều mô cơ quan khác nhau nhƣ cơ, não, và mô mỡ [52] Ngày nay, tế bào gốc trung mô từ tủy xƣơng và. .. 2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của tế bào gốc mô mỡ đến tế bào da nuôi cấy Để xác định hiệu quả của các yếu tố hòa tan bởi ADSCs lên sự tăng sinh và di cƣ của hai loại tế bào, nguyên bào sợi da và tế bào sừng đƣợc đồng nuôi cấy với tế bào gốc mô mỡ trong 2 khoang đĩa để tránh sự tiếp xúc trực tiếp giữa các loại tế bào nhƣng lại cho phép sự trao đổi các yếu tố có khả năng khuếch tán Hình 2 Mô... số loại tế bào và vật liệu điều trị vết thương từ nuôi cấy tế bào Trị liệu tế bào nói chung đã mang lại một số kết quả đáng kể trong lâm sàng, một số tế bào đƣợc nuôi cấy và ứng dụng phổ biến là: Tế bào sừng (Keratinocyte) Trong vài thập niên trở lại đây, cấy ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy đã đƣợc triển khai tại các trung tâm điều trị bỏng lớn ở Anh, Mỹ, Nhật Việc cấy ghép tế bào sừng lên vết thƣơng... cƣ của chúng theo cách thức mô tả dƣới đây 2.2.5.1 Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến tăng sinh nguyên bào sợi Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da đƣợc cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×104 TB/giếng và duy trì trong môi trƣờng tăng sinh tế bào gốc trung mô bao gồm DMEM/1 FBS/1 AB Nguyên bào sợi đƣợc cấy trong 3 ngày trƣớc khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh Tế bào MSC đƣợc cấy. .. có tế bào 2 Insert có tế bào là nguyên bào sợi da cấy ở mật độ 5x103TB/insert và duy trì trong môi trƣờng tăng sinh MSC trong 6 ngày trƣớc khi đồng nuôi cấy Tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, các giếng nguyên bào sợi đƣợc trypsin và đếm số lƣợng tế bào cũng nhƣ xác định tỷ lệ sống/chết của tế bào thu đƣợc 2.2.5.2 Đánh giá ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mô mỡ lên khả năng di cư của nguyên bào. .. bào gốc mô mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau nhƣ tế bào xƣơng, tế bào tiết insulin, tế bào sụn [45], [84], [85] Tác giả Xu W (9-2014) đã biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào dạng nguyên bào sợi để điều trị vết thƣơng ở thanh quản [36] Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thƣơng thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một trong những dạng tế ... tế bào da nuôi cấy định hướng điều trị vết thương nhằm mục tiêu sau: Đánh giá đặc điểm phân lập tăng sinh tế bào gốc mỡ điều kiện nuôi cấy invitro Đánh giá ảnh hưởng tế bào gốc mỡ đến tế bào da. .. - ĐOÀN HOÀNG THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƢỚNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã... bỏng điều trị nhu cầu ghép da chiếm khoảng 2500 bệnh nhân Xuất phát từ sở khoa học tiềm ứng dụng tế bào gốc mỡ, tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hưởng chúng đến tế