trích ly enzyme protease từ ruột cá tra

Đặc biệt, kết hợp khảo sát tác động của 2 yếu tố pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease, quy hoạch thí nghiệm theo phương pháp giai thừa với 2 yếu tố, 4 mức can thiệp, thực hiện tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

*********

LUẬN VĂN TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ RUỘT

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Vương Tường Vân với sự hướng dẫn của Ts Huỳnh Thị Phương Loan Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện Luận văn đính kèm

theo đây, với đề tài “Trích ly enzyme protease từ ruột cá tra” đã được hội đồng

chấm luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

GV hướng dẫn Người viết

Huỳnh Thị Phương Loan Nguyễn Vương Tường Vân

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận văn này em đã nhận được sự giúp đỡ từ rất nhiều phía Trước hết,

em xin cám ơn Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo môi trường thuận lợi nhất cho em học tập và nghiên cứu trong thời gian thực hiên luận văn này

Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô trong bộ môn, đặc biệt là cô Huỳnh Thị Phương Loan đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn

Bên cạnh đó, cũng xin các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 37 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại trường

Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công

Em xin chân thành cám ơn!

TÓM TẮT

Nghiên cứu khả năng trích ly enzyme protease từ ruột cá tra nhằm thông qua đó xác định điều kiện tối ưu của quả quá trình trích ly như: tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi, thời gian trích ly, pH, nhiệt độ Đặc biệt, kết hợp khảo sát tác động của 2 yếu tố pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease, quy hoạch thí nghiệm theo phương pháp giai thừa với 2 yếu tố, 4 mức can thiệp, thực hiện trên 16 mẫu thí nghiệm

Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi để quá trình trích ly tối ưu nhất là tỉ lệ 1/2 Thời gian trích ly tối ưu là 10 phút Đồng thời, quá trình trích

ly cho hoạt tính enzyme đạt cao nhất khi điều chỉnh pH môi trường trích ly là 9 kết hợp với điều kiện nhiệt độ 40°C

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG vii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Nội dung nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Cá tra 2

2.1.1 Đặc điểm sinh học 2

2.1.2 Sơ lược hệ tiêu hóa của cá tra 3

2.1.2.1 Dạ dày – dịch vị – pepsin 3

2.1.2.2 Ruột – dịch ruột – tripsin và erepsin 3

2.1.2.3 Tụy – dịch tụy 4

2.2 Khái quát chung về enzyme protease 4

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu enzyme 4

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 4

2.2.2.1 Nồng độ enzyme 5

2.2.2.2 Nồng độ cơ chất 6

2.2.2.3 Nhiệt độ 7

2.2.2.4 pH 7

2.2.2.5 Các chất kìm hãm 8

2.2.2.6 Các chất hoạt hóa 9

2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease 9

2.2.3.1 Về nguồn gốc thực vật 9

2.2.3.2 Về nguồn gốc vi sinh vật 12

2.2.3.3 Về nguồn gốc động vật 13

2.2.4 Ứng dụng của enzyme trong sản xuất 17

2.2.4.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 17

2.2.4.2 Ứng dụng trong phân tích 18

2.2.4.3 Ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và nông nghiệp 18

2.2.4.4 Ứng dụng trong công nghiệp năng lượng 19

2.3 Các nghiên cứu đã được thực hiện 19

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.2 Vật liệu 20

3.3 Hóa chất 20

3.4 Thiết bị và dụng cụ 20

3.5 Phương pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra 21

3.6 Bố trí thí nghiệm 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25

4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme protease 25

4.3 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease trích ly 27

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

5.1 Kết luận 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH PROTESE ix

PHỤ LỤC 2: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ xii

Thí nghiệm 1 xii

Thí nghiệm 2 xiv

Thí nghiệm 3 xvi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Con cá tra 2

Hình 2.2: Lớp biểu mô dạ dày 3

Hình 2.3: Nội tạng cá tra 4

Hình 2.4: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] 6

Hình 2.5: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 6

Hình 2.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 7

Hình 2.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme 7

Hình 2.8: Cơ chế hoạt động của enzyme 8

Hình 2.9: Trái dứa 9

Hình 2.10: Cấu trúc glycan của enzyme bromelin 10

Hình 2.11: Quả đu đủ xanh 11

Hình 2.12: Cấu trúc bậc 2 của papain 11

Hình 2.13: cây sung ngọt (Ficus carica) 12

Hình 2.14: Cấu trúc của pepsin và pepsinogen 13

Hình 2.15: phân tử rennin 15

Hình 2.16: Sự hoạt hóa tripsinogen thành tripsin 16

Hình 2.17: Sự hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotrypsin 17

Hình 2.18: Enzyme chymotripsin B 18

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme protease từ ruột cá Tra 21

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 22

Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 23

Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 24

Hình 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ ruột/ dung môi đến hoạt tính protease trích ly 25

Hình 4.2: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính protease 26

Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme protease 27

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên 2

Bảng 2.2: Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển enzyme 4

Bảng 2.3: Một số tính chất của protease (P) tổng hợp protease 10

Bảng 2.4: Tỷ lệ sử dụng của một số enzyme trên thế giới 17

Bảng 2.5: Thị trường enzyme trong công nghệ thực phẩm 18

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của các nhân tố đến phương trình hồi quy 28

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ở đồng bằng sông Cửu Long, chế biến thủy sản là một trong những nghành đặc biệt phát triển nhờ vào đặc điểm khí hậu và nguồn nước thích hợp cho việc nuôi trồng nhiều loại thủy sản Cá tra, cá basa là loại cá dễ nuôi, được nuôi nhiều trong bè ven sông hay trong ao, đây là loài cá có giá trị kinh tế cao và được xuất khẩu đi nhiều nước trên thế giới Các dạng sản phẩm chính của cá tra, cá basa như cá fillet, cá tra, basa xiên que, chả cá, cá cắt khúc, cá nguyên con… Hiện nay, các nhà máy thủy sản sản xuất khoảng 4000 tấn nguyên liệu/ ngày, tạo ra hơn 2000 tấn phế phẩm trong đó gồm nội tạng, mỡ cá, xương cá, máu cá,… đây là nguồn nguyên liệu lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm phụ nhưng vẫn chưa được tận dụng một cách triệt để, việc thải một lượng lớn phế phẩm này ra môi trường đã gây ra những vấn đề ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trường sống của con người và các loài sinh vật Vì vậy, nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích giải quyết những vấn đề nan giải về môi trường và làm tăng giá trị cho con cá tra, cá tra thông qua việc tận dụng tối đa các bộ phận của con cá

Mỡ cá tra, cá basa được tận dụng để sản xuất ra dầu bio-diesel, máu cá có hàm lượng protein khoảng 15% trong đó chủ yếu là albumin, globulin và fibrinogen thì được sử dụng để sản xuất bột máu bổ sung vào nguồn thức ăn cho động vật Xương cá cũng

có thể xay thành bột để làm tức ăn gia súc, làm phân bón, xương cá cũng có thành phần collagen nên có thể dung để nấu keo…

Nội tạng cá (chiếm tỉ lệ khoảng 12,04% khối lượng phế phẩm) có chứa nhiều loại enzyme, đặc biệt là nguồn enzyme protease dồi dào nhưng vẫn chưa được sử dụng một cách hợp lí nên gây lãng phí lớn

Từ những vấn đề trên, đề tài trích ly enzyme protease từ nội tạng cá tra được thực hiện nhằm trích ly enzyme từ nội tạng cá để tạo nên chế phẩm enzyme protease

1.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định ảnh hưởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme protease từ nội tạng cá

- Tối ưu điều kiện trích ly enzyme protease với hoạt tính enzyme cao nhất

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Cá tra

2.1.1 Đặc điểm sinh học

Cá tra có tên khoa học là Pangasius hypophthalmus là loài cá thường được nuôi

nhiều trong ao, bè ở các tỉnh Tây Nam Bộ Về hình thái sinh lý, cá tra là loại cá da trơn, thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng và có hai râu dài, sống chủ yếu ở nước ngọt và chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới 10 phần nghìn), chịu đựng được nước phèn pH >4.(M.D Menon and Cheko,1995)

Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể sống được ở những ao hồ chật hẹp và chịu được mật độ nuôi cao Khi thiếu oxy thì cá có thể hớp không khí trên mặt nước, oxy

sẽ được đi vào máu qua niêm mạc ruột và khí thừa sẽ theo hậu môn ra ngoài

Cơ quan tiêu hóa của cá tra gồm miệng, răng hàm, gai mang, dạ dày to hình chữ U, túi mật lớn, ruột Thức ăn của cá tra thường là những động vật nhỏ, thực vật, giáp xác,…

Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên

2.1.2 Sơ lược hệ tiêu hóa của cá tra

Để duy trì sự sống của cơ thể thì hệ tiêu hóa là rất quan trọng Thức ăn là nguồn nguyên liệu cần thiết để cơ thể tồn tại và phát triển , các chất dinh dưỡng từ thức ăn được hấp thụ thông qua hệ tiêu hóa Do cá sống trong môi trường nước nên tác dụng làm ướt thức ăn của nước bọt là không thiết yếu do vậy khoang miệng của cá nói chung không có tuyến tiêu hóa, miệng cá có vai trò chủ yếu là bắt giữ mồi

Thức ăn được tiêu hóa chủ yếu là nhờ tác dụng của dịch tiêu hóa do các tuyến tiết ra, được chứa trong ống tiêu hóa

2.1.2.1 Dạ dày – dịch vị – pepsin

Trong dạ dày có các tuyến tiết ra dịch vị có tác dụng tiêu hóa đối với protein Độ pH trong dạ dày của cá rất thấp Vd: pH ở dạ dày cá hồi là 3.1 trong khi pH ở ruột non là 6.4 Trong dịch vị có enzyme pepsin, hoạt tính tối ưu trong điều kiện pH 1.7 – 3.0 và nhiệt độ là 30 – 50oC Ngoài ra, HCl cũng được tiết ra, có vai trò quan trọng trong

quá trình tiêu hóa thức ăn và chuyển hóa của pepsinogen

Hình 2.2: Lớp biểu mô dạ dày

(Nguồn:http://websrv1.ctu.edu.vn/coursewares/khoahoc/sinhhocdc_a2/phan2/ch7)

Tác dụng của HCl:

- Chuyển hóa pepsinogen thành pepsin hoạt động

- Làm nở các mô liên kết của thức ăn, làm tan các chất keo

- Thủy phân đường đôi như saccarose…

- Diệt khuẩn: có tác dụng diệt khuẩn đối với một số vi sinh vật như E.coli, tụ cầu…

- Đóng mở môn vị

Tác dụng của pepsin:

- Phân giải protein không triệt để thành các chuỗi popypeptide mạch ngắn

2.1.2.2 Ruột – dịch ruột – tripsin và erepsin

Dịch ruột được tiết ra do các tuyến ruột non, là một chất không màu, có tính chất kiềm Tripsin ở đoạn ruột trước nhiều hơn ở đoạn ruột sau, erepsin do tuyến ruột ở niêm mạc ruột tiết ra và tồn tại trong dịch ruột Hai nhóm enzyme chính có trong ruột là:

- Nhóm enzyme tiêu hóa protein gồm aminopeptidase và dipeptidase gọi chung

là erepsin, chỉ có thể phân giải protein có phân tử lượng nhỏ như peptone và proteoza thành amino acid

- Enzyme enterakinase có tác dụng hoạt hóa tripsinogen thành tripsin Tripsin là enzyme hoạt động trong môi trường kiềm tính, có tác dụng thủy phân không triệt để protein thành các phân tử peptide mạch ngắn (Nguyễn Đức Lượng,2004)

Hình 2.3: Nội tạng cá tra

(Nguồn: http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1230)

2.1.2.3 Tụy – dịch tụy

Dịch tụy do tụy tạng tiết ra, độ pH = 8 Trong dịch tụy có nhiều enzyme tiêu hóa

- Trypsinogen và chymotripsinogen, peptidase Tripsinogen khi gặp enterokinase của ruột sẽ được hoạt hóa thành tripsin Chymotripsinogen khi gặp tripsin sẽ được hoạt hóa thành chymotripsin

- Lipase của tụy là một enzyme tiêu hóa mạnh, thủy phân lipid thành glycerin

và acid béo

2.2 Khái quát chung về enzyme protease

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu enzyme

Bảng 2.2: Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển enzyme

Rohm sử dụng protease trong công nghệ thuộc da

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme

Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, nồng

độ cơ chất, nhiệt độ, pH, các ion kim loại…Dưới đây sẽ xét đến các yếu tố thường gặp và có tác động nhiều nhất đến vận tốc phản ứng của enzyme

Rohm sử dụng enzyme làm chất tẩy rửa

Boidin và Effront nghiên cứu α-amylase của B.subtilis và được

ứng dụng trong nghành dệt Will Slitter tinh sạch được enzyme Samner kết tinh được urease và Northrop kết tinh được protease Fleming phát hiện ra penicilline

Tanabe co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid Sử dụng glucose isomerase trong sản xuất dung dịch đường giàu fructose

Boyer et al đưa ra kỹ thuật di truyền Kỹ thuật này có tác động tích cực đến công nghệ enzyme

Tanabe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào Winter và Ferch đưa ra công nghệ sản xuất protein

Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry – lamide và một loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme

Phát hiện ra hàng trăm loại enzyme khác nhau, đã đưa vào sản xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống

Hình 2.4: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

(Nguồn: https://voer.edu.vn/m/dong-hoc-enzyme/0a676f67)

2.2.2.2 Nồng độ cơ chất

Phương trình Michaelis – Menten cho ta thấy rõ mối quan hệ của nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng Km được gọi là hằng số Michaelis – Menten đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn (Nguyễn Công Hà, Lê Nguyễn Đoan Duy,2011)

Hình 2.5: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

(Nguồn: https://voer.edu.vn/c/khai-niem-chung-ve-trao-doi-chat-o-vi-sinh-vat/)

Phương trình động học Michaelis – Menten cho thấy sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme vào nồng độ cơ chất (hình 2.5), phương trình này liên kết tốc độ phản ứng (V), nồng độ cơ chất (S) với tốc độ cực đại (Vmax) và hằng số Michaelis (Km) Với:

Km là hằng số Michaelis đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất và Vmax là tốc

độ tạo thành sản phẩm khi enzyme được bão hòa cơ chất và hoạt động nhanh tối đa (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng tăng, khi [S] tăng đến một giá trị nào đó thì vận tốc đạt cực đại và sẽ không tiếp tục tăng nếu [S] vẫn tăng Điều này cho thấy khi nồng độ

cơ chất tăng đến một giới hạn nào đó thì cơ chất sẽ ức chế hoạt động của enzyme làm ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng

2.2.2.3 Nhiệt độ

Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trường, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant - Hoff Khi tăng nhiệt độ lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần (Nguyễn Minh Thủy,2005)

Hình 2.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme

(Nguồn: https://sites.google.com/site/hoangnhi2/)

Phản ứng do enzyme xúc tác cũng chịu ảnh hưởng của định luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein.Khi ta tăng nhiệt độ lên quá cao thì enzyme sẽ bị biến tính, phần lớn enzyme có nhiệt độ tối thích trong khoảng 30 –

50oC Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm (hình 2.6).Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc vào nguồn cung cấp enzyme, cũng có enzyme có nhiệt độ tối thích cao trong khoảng nhiệt độ từ 60 –

70oC

2.2.2.4 pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm hoạt động, là nơi liên kết với cơ chất của phân tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Mỗi enzyme có một pH tối thích khác nhau, phần lớn enzyme có pH tối ưu trong khoảng 4 – 6

Ảnh hưởng của pH lên vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có dạng như hình 2.7

Hình 2.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme

(Nguồn: https://voer.edu.vn/m/dong-hoc-enzyme/0a676f67)

Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau:

 Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp

pH Vận tốc phản ứng

 Ở hai sườn của pH tối thích có thể xảy ra sự phân ly nhóm prosthetic hay coenzyme

 Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly cơ chất

 Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và thay đổi hoạt tính cực đại

2.2.2.5 Các chất kìm hãm

Hoạt độ enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau Các chất làm giảm hoạt độ enzyme nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme được gọi là các chất kiềm hãm hoặc các chất ức chế Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein

Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme Nhiều chất khác không làm biến tính enzyme nhưng vẫn kìm hãm hoạt động của enzyme theo một cơ chế khác Các chất này có thể kìm hãm hoạt động của enzyme theo hướng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch (Lê Ngọc Tú,2004)

Nếu là kìm hãm thuận nghịch thì phản ứng kết hợp giữa enzyme và chất kìm hãm nhanh chóng đạt đến cân bằng Trong trường hợp kìm hãm không thuận nghịch, k-1(hình 2.8b) rất bé có thể xem như bằng không, I kết hợp với E bằng liên kết đồng hóa trị hoặc liên kết rất chặt khó có thể tách khỏi E, sự phân ly của phức EI là rất chậm

Hình 2.8: Cơ chế hoạt động của enzyme a: Mô hình trung tâm hoạt động của Fisher, b: Mô hình của Koshland

(Nguồn: https://voer.edu.vn/m/cau-truc-phan-tu-enzyme/c2b85cd6)

K1

K-1

2.2.2.6 Các chất hoạt hóa

Là chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ như các vitamin tan trong nước làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydro hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc là những chất có khả năng phục hồi những nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme (Lê Ngọc Tú,2004)

Tính chất hoạt hóa của các cation kim loại:

 Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho một kiểu phản ứng nhất định

 Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối

 Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion

 Phụ thuộc nồng độ cation kim loại

 Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích

2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease

Trong ngành công nghiệp thực phẩm thường sử dụng rất nhiều protease để hỗ trợ quá trình sản xuất nhằm tăng khả năng sản xuất sản phẩm và hạ giá thành sản phẩm Enzyme protease có thể được thu nhận chủ yếu từ 3 nguồn là thực vật, động vật và vi sinh vật

2.2.3.1 Về nguồn gốc thực vật

Bromelin từ cây dứa:

Dứa có tên khoa học là Ananas comusus, thuộc họ Bromeliaceae Cây dứa là loại cây

được sử dụng hầu hết các bộ phận như phần thân và lá thì được sử dụng làm giấy hoặc làm phân bón Quả dứa được sử dụng làm thực phẩm và có thể sử dụng các phế phẩm để trích ly enzyme bromelin

Hình 2.9: Trái dứa

(Nguồn: http://www.thaphimex.com/vi/tin-tuc-va-su-kien/tin-rau-hoa-qua/)

Trong quả dứa chín, cacbohydrate chiếm 10 – 18% (trong đó có 60 -67% saccharose, glucose và fructose chiếm 30 – 40%), protein 2 – 3%, acid hữu cơ 0,1 – 1.6% Bromelin là tên gọi của nhóm enzyme thực vật có chứa sulfhydryl, có khả năng phân giải protein

Năm 1957, tiến sĩ Ralph Heinicke nhận thấy trong thân dứa có một lượng lớn bromelin và bắt đầu được chiết tách nó để đưa vào sản xuất Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa thì bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau

Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, pH tối ưu nằm trong khoảng 6 – 8, có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da

Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin kể từ ba tháng trước khi chín, trong

đó hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảm xuống Thông thường, người ta có thể thu được trung bình 3.6 kg bromelin từ 378 lít dịch quả dứa

Hình 2.10: Cấu trúc phần glycan của enzyme bromelin

(nguồn: http://www2.hcmuaf.edu.vn/data/mnam/image/) Bromelin là một protease có bản chất là một sợi glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose Sợi hydrat carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide Bromelin quả có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 283 – 161 amino acid

Bromelin thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầu carbohydrate là glycine, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanine Bromelin là một protease mà trung tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối – S – S – , phân tử có dạng hình cầu Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase

Trong một thử nghiệm hoạt tính phân giải của bromelin, người ta ghi nhân được hoạt tính phân giải casein của bromelin phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của quả dứa (chin, xanh) như: bromelin thân của quả vừa chín tới là 7.4 UI/ mg, của bromelin quả xanh

là 4.0 UI/ mg và của bromelin quả chín là 3 UI/ mg

Papain thu nhận từ đu đủ xanh:

Papain thường được lấy từ nhựa của quả còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0,3 – 1 kg Nhựa đu đủ phải chứa trong bình thủy tinh sậm màu, tránh tiếp xúc với không khí để đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa

Hình 2.11: Quả đu đủ xanh

(Nguồn: http://khoahocthoidai.vn/news.aspx?id=12Z80Z1432)

Nhựa là hỗn hợp các enzyme protease: papain, chymopapain A (gốc acid amin cuối

là glutamic acid), chymopapain B (gốc acid amin cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease Trong đó, hàm lượng papain chiếm trên 95% tổng hàm lượng protease có trong nhựa đu đủ Papain là một endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S

Theo nghiên cứu của Smith (1960) và Hill (1965), papain là một chuỗi polypeptide

có 185 amino acid, có trọng lượng phân tử khoảng 20900 Dalton Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain được cấu tạo bởi 212 amino acid không có methionine Phân

tử lượng 23350 Da, phân tử papain là một chuỗi polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo ra 3 cầu liên kết disulfur

Hình 2.12: Cấu trúc bậc 2 của papain

(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Enzym)

Trung tâm hoạt động của papain gồm có nhóm – SH của cysteine và nitrogen bậc 3 của histidine, nhóm imidazole của histidine cũng liên kết với Asp bởi liên kết hidro Papain thủy phân protein thành các polypeptide và acid amin Papain có thể thủy phân hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline, với các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do Hoạt tính của enzyme papain được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại như EDTA Papain bị kìm hãm bởi các chất oxy hóa như: oxi, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobenzoate, cystine và các hoạt chất disulfur khác

Ficin từ nhựa của cây thuộc họ sung, vả:

Ficin là một protease được tìm thấy trong nhựa của cây sung, vả, thuộc họ Moraceae

Ngày xưa, con người đã biết sử dụng nhựa của các cây họ sung để làm đông sữa trong sản xuất phô mai Năm 1930, Robbins nhận thấy trong nhựa của các cây họ sung có một loại enzyme có thể tiêu diệt được giun tròn Ascaris, ông đặt tên cho nó

là ficin Trong đó, sung ngọt là loại cây có nhiều nhựa trắng đục, có sản lượng cao và được trồng phổ biến ở Hoa Kỳ, Tây Ban Nha, Ai Cập… Nhựa được thu vào buổi sáng thì enzyme ficin có hoạt tính cao nhất, sấy khô để dùng trong công nghiệp thực phẩm

Hình 2.13: Cây sung ngọt (Ficus carica)

(Nguồn: www.compagniadelgiardinaggi) Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulhydryl (- SH) Trình tự các amino acid trong trung tâm phản ứng của ficin

– Pro – Leu – Arg – Gln – Gly – Glu – Cys – Gly – Ser – Cys – Tryp –

Trọng lượng phân từ: 23000 – 27000 Da

Nhiệt độ hoạt động: 30 – 80oC, nhiệt độ tối ưu là 50 – 65oC

Điểm đẳng điện: 9 – 10

pH hoạt động của ficin rộng: 4 – 9.5

Ficin có thể thủy phân liên kết của các protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành,

gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả Ascaris sống ficin cũng có thể thủy

phân các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo

2.2.3.2 Về nguồn gốc vi sinh vật

Enzyme là một loại protein có tác dụng xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào, cơ thể Ngày nay, vi sinh vật là đối tượng được sử dụng trong sản xuất enzyme ngày nay Giống vi sinh vật trong sản xuất enzyme quyết định đến:

- Khả năng sinh tổng hợp enzyme

- Hoạt tính enzyme

- Ảnh hưởng đến năng suất tổng hợp enzyme

Nhiều VSV có khả năng tổng hợp protease Dựa vào cơ chất, pH hoạt động có thể chia protease thành 4 loại: protease acid, protease kim loại, protease thiol, protease xerin

Một số tác giả căn cứ vào pH hoạt động lại chia protease thành 3 loại là: protease trung tính, protease acid, protease kiềm Các protease thiol, protease xerin có khả năng phân giải liên kết ester và liên kết amide của amino acid, ngược lại các protease

Trong quá trình xúc tác của enzym vùng cấu trúc không gian đặc biệt tham gia trực tiếp vào phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động" Cấu tạo đặc biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của enzyme

Bảng 2.3: Một số tính chất của protease (P) tổng hợp protease

Nhóm Nguồn enzyme Đặc điểm trung tâm hoạt động pH tối ưu

P xerin  Bac Subtilis

Kim loại hóa trị 2 Trung tính

329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleucin(Nguyễn Đức Lượng.2004)

Hình 2.14: Cấu trúc của pepsin và pepsinogen

(Nguồn: http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=12)

Pepsin

pepsinogen Peptide kìm hãm (tương ứng khoảng 41 amino acid)

Trong cơ thể sinh vật, pepsin được tiết ra dưới dạng là pepsinogen Khi tiếp xúc với môi trường acid của dạ dày hay pepsin thì pepsinogen sẽ được hoạt hóa thành pepsin Quá trình hoạt hóa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptide và giải phóng

ra chuỗi peptide kìm hãm, thành phần của chuỗi peptide kìm hãm này bao gồm 41 amino acid của pepsinogen (Koen và cộng sự,1968)

Pepsin hoạt động chủ yếu ở pH 1.7 – 2.2, tham gia quá trình thủy phân protein thành các polypeptide mạch ngắn Pepsin tác động lên hầu hết các protein tự nhiên và

có khả năng phân cắt tới 30% liên kết peptide có trong phân tử protein tạo thành chủ yếu các peptide chứa từ 5 – 8 acid amin

Sự tự phân giải của pepsin

Pepsin vừa có bản chất là protein vừa là enzyme phân giải protein nên pepsin có khả năng tự phân hủy Theo Ingram (1955), trong quá trình pepsin tự tiêu hóa ở nhiệt độ

45oC, pH = 4 trong 24 giờ, nhận thấy có 45% tyrosine của phân tử enzyme được giải phóng và kết tinh, ngoài ra còn xuất hiện các peptide có phân tử lượng nhỏ từ 1000 –

2000 Da Theo Perlmann (1955), sự tiêu hóa của pepsin tạo ra những sản phẩm có thể thẩm tích và có hoạt động phân giải protein, chỉ còn lại khoảng 64% hoạt tính gốc, hoạt tính này được kiểm tra trên hemoglobin

Tóm lại, sự tự tiêu của pepsin thường xảy ra trong điều kiện pepsin ở dạng dung dịch,

pH thấp, nhiệt độ thích hợp, tạo ra nhiều thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn pepsin

b/ Enzyme có trong ruột

Tripsin

Tripsin hoạt động trong môi trường kiềm ở ruột nên thuộc loại protease kiềm tính Vai trò của tripsin là tiếp tục thủy phân các protein sau khi trãi qua quá trình tiêu hóa ở dạ dày Tripsin được tiết ra ở dạng không hoạt động là tripsinogen, sau đó được chuyển thành tripsin dưới tác động của enzyme ruột enterokinase và bởi chính tripsin (Nguyễn Hữu Chấn,1983)

Enzyme tripsin được tụy tiết ra dưới dạng không hoạt động là tripsinogen, sau đó tripsinogen được chuyển hóa thành tripsin dưới tác dụng của enzyme đường ruột enterokinase và bởi chính tripsin Tripsinogen là một chuỗi polypeptide mạch thẳng gồm 229 amino acid và có trọng lượng phân tử khoảng 23048 – 23800 Dalton (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự,2004)

Cơ chế hoạt hóa tripsinogen

Có 2 cơ chế để hoạt hóa tripsinogen đó là xúc tác nhờ enzyme đường ruột enterokinase và tự xúc tác Quá trình tự xúc tác này chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của một lượng nhỏ enzyme tripsin, nếu hàm lượng tripsin lớn thì quá trình tự xúc tác sẽ

bị ức chế

Tripsin Enterokinase

Hình 2.15: Sự hoạt hóa tripsinogen thành tripsin

(Nguồn: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics.html)

Đặc điểm cấu tạo tripsin

Tripsin là một chuỗi polypeptide trọng lượng phân tử khoảng 22680 – 23400 Da pH tối ưu cho hoạt động của tripsin là 8 và pH thích hợp của tripsin là 7.8 – 9.5 Nhiệt độ thích hợp trong khoảng 30 – 40oC Ở nhiệt độ này và pH 8.5 – 9, tripsin có khả năng thủy phân mạnh các loại cơ chất như casein, hemoglobin hay gelatin Khi đun nóng dung dịch enzyme đến 90oC và pH trong khoảng 6 – 8 thì enzyme bị mất hoạt tính Tripsin có trung tâm hoạt động bao gồm các amino acid như:

- Gly – Asp – Ser – Gly – Pro - Tripsin là một loại enzyme thủy phân protein không triệt để Khi sử dụng tripsin thì chỉ có 1/3 liên kết peptide trong phân tử protein là bị thủy phân, phần còn lại là các peptide mạch ngắn Tripsin cắt các liên kết được tạo ra bởi nhóm carboxyl của lysine hay arginine với nhóm amine của các amino acid bất kỳ và tripsin không cắt liên kết giữa lysine và arginine

Hoạt tính phân cắt cơ chất

Các phân tử protein khi bị cắt bởi tripsin sẽ tạo ra những peptide có trọng lượng phân

tử nhỏ và đôi khi cũng tạo ra các amino acid tự do như tryptophan, tyrosine Ngoài

hoạt động thủy phân liên kết peptide, tripsin còn có thể thủy phân liên kết ester

Chymotripsine

Chymotripsin là một protease được tiết ra từ tụy, là một protease có tính kiềm Chymotripsin được tiết ra dưới dạng không hoạt động là chymotripsinogen, sau đó được chuyển thành chymotripsin nhờ tác dụng của tripsin

Cơ chế hoạt hóa chymotripsinogen

Quá trình chymotripsinogen được hoạt hóa thành chymotripsin diễn ra như sau: Đầu tiên, tripsin phân cắt liên kết giữa hai amino acid là arginine 15 và isoleucine 16

sẽ tạo thành π – chymotripsin có hoạt tính thủy phân nhưng không bền Sau đó, tripsin tiếp tục cắt đứt liên kết giữa hai amino acid khác là serine 14 và arginine 15 để

Enterokinase Peptide ức chế

tạo ra δ – chymotripsin Cuối cùng, là tách dipeptide bao gồm threonine 148 và asparagines 149 sẽ hình thành α – chymotripsin α – chymotripsincó cấu trúc không gian đƣợc giữ bằng 5 cầu nối disulfur (hình 2.16)

Hình 2.16: Sự hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotripsin

(Nguồn: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics.html)

Chymotripsin đƣợc cấu tạo tử 3 sợi polypeptide:

 Sợi A: các amino acid từ 1 – 13

 Sợi B: các amino acid từ 16 – 146

 Sợi C: các amino acid từ 149 – 245

Các sợi này liên kết với nhau bằng cầu nối disulfit Các sợi polypeptide liên kết với nhau tạo thành dạng hình cầu Cấu trúc thứ cấp của enzyme có dạng β

Chymotripsin có bộ ba amino acid xúc tác phản ứng là – Ser195 – His57 – Asp102 – Những amino acid này tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme hỗ trợ cho hoạt động xúc tác (hình 2.17)

Chymotripsin hoạt động trong điều kiện pH 7 – 9 và pH tối ƣu là 8 – 9, điểm đẳng điện pI = 5.4, là chuỗi polypeptide có 245 amino acid có trọng lƣợng phân tử 22500 dalton Chymotripsin xúc tác sự thủy phân liên kết peptide của các phân tử protein và phân cắt có chọn lọc những liên kết peptide trong chuỗi polypeptide ở vị trí đầu – C của amino acid có nhân thơm nhƣ triptophan, tyrosine, phenylalanine

Chymotripsin hoạt động nhƣ một endopeptidase phân cắt mạch polypeptide thành các peptide mạch ngắn và tác dụng trên những liên kết mà tripsin không phân cắt Những liên kết này đƣợc tạo thành bởi nhóm carboxyl của amino acid có nhân thơm nhƣ tyrosine, tryptophan, phenylalanine với nhóm amin của amino acid khác Đây là enzyme có khả năng phân cắt đƣợc cả liên kết peptide và liên kết ester

Hình 2.17: Enzyme chymotripsin B

(Nguồn: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chymotrypsin_4cha.png)

2.2.4 Ứng dụng của enzyme trong sản xuất

Ngày nay, việc sản xuất enzyme đã được phát triển ở quy mô công nghiệp và sản phẩm enzyme đã được ứng dụng phổ biến trong các nghành nghề phục vụ cho sản xuất Số lượng enzyme được phát hiện và sử dụng ngày càng nhiều Việc sử dụng enzyme thương mại trên thị trường thế giới được thể hiện qua bảng sau:

Bảng 2.4: Tỷ lệ sử dụng của một số enzyme trên thế giới

 Protease kiềm yếu

 Protease kiềm mạnh dùng trong chất tẩy rửa

Enzyme hầu hết có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật Ở Việt Nam, việc sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp chưa phát triển và vẫn còn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài

Bảng 2.5: Thị trường enzyme trong công nghệ thực phẩm

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Lĩnh vực công nghiệp và

enzyme

Giá trị (triệu USD)

Lĩnh vực công nghiệp và

enzyme

Giá trị (triệu USD)

Chuyển hóa tinh bột

vệ con người khỏi các độc tố nguy hiểm

2.2.4.3 Ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và nông nghiệp

Y học: Ngày nay, người ta có thể ứng dụng tính đặc hiệu của enzyme để sản xuất ra

các loại dược phẩm như glucosamine sulphat hay sản xuất ra các chất kháng sinh bán tổng hợp và các dẫn xuất của chất kháng sinh Bên cạnh đó protease như trypsine, α-chymotrypsine dùng sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp rất thông dụng trên thị trường dược phẩm

Trong mỹ phẩm: trộn một lượng nhỏ protease vào keo xoa, keo cạo râu, dầu gội,

dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào da

Trong nông nghiệp: protease được bổ sung vào thức ăn động vật nuôi nhằm tăng