một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông, loại dung dịch đệm có pH 6 thích hợp cũng như thời gian và nhiệt độ trích ly đến quá trình thu nhận enzy

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS Trần Thanh Trúc Nguyễn Mỹ Trinh

MSSV: 2111665

Lớp Công nghệ thực phẩm khóa 37

2014

LỜI CẢM ƠN

Trong khoảng thời gian hơn 4 tháng, nhờ sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của thầy cô, các anh chị cao học khóa 20, các bạn sinh viên Công nghệ

Thực phẩm khóa 37 và 38,… đã giúp em hoàn thành đề tài luận văn “Một số

yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc”

Để có được thành quả ngày hôm nay, em xin chân thành cám ơn cô Trần Thanh Trúc và thầy Nguyễn Văn Mười Em cám ơn thầy cô đã giúp đỡ

và hỗ trợ em về mọi mặt để em có thể hoàn thành đề tài luận văn của mình Sự giúp đỡ và tình cảm của thầy cô thật sự có ý nghĩa rất lớn đối với em

Em xin cám ơn thầy cô và các anh chị làm việc tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện và thời gian cho em thực hiện đề tài cũng như sử dụng các trang thiết bị của Bộ môn

Em cũng xin cám ơn các anh chị học viên cao học ngành Công nghệ Thực phẩm khóa 20, đặc biệt là anh Trần Thế Hiển đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ em giải quyết nhiều vấn đề khó khăn trong lúc thực hiện đề tài

Tôi xin cám ơn các bạn sinh viên Công nghệ Thực phẩm khóa 37 và 38, các bạn là những người luôn đồng hành, cổ vũ, động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều

Cuối lời, con xin cám ơn cha mẹ đã luôn bên cạnh con là động lực để con cố gắng, phấn đấu trong cuộc sống

Em xin chân thành cám ơn!

Cần Thơ, ngày 16 tháng 12 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Mỹ Trinh

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm mục đích xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông, loại dung dịch đệm có pH 6 thích hợp cũng như thời gian và nhiệt độ trích ly đến quá trình thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá lóc Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp chuẩn độ liên tục pH-stat bằng NaOH 0,05 N đến pH 9 Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu quả trích ly lipase đạt tốt nhất với hoạt tính lipase thu được là 17,16 U/g, chất khô nguyên liệu (CKNL) khi sử dụng dung

thời gian 211,2 phút Ngoài ra, hoạt tính lipase trong nguyên liệu vẫn được

Từ khoá: đệm phosphate, lipase, nhiệt độ trích ly, nội tạng cá lóc, thời gian

trích ly, thời gian trữ đông

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài luận văn tốt nghiệp “Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả

trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc” là công trình nghiên cứu của sinh

viên Nguyễn Mỹ Trinh với sự hướng dẫn của Tiến sĩ Trần Thanh Trúc Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện

Cần Thơ, ngày 16 tháng 12 năm 2014

Nguyễn Mỹ Trinh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nguyên liệu 3

2.1.1 Giới thiệu về cá lóc 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học của cá lóc 4

2.1.3 Tình hình nuôi và tiêu thụ cá lóc hiện nay 4

2.2 Tổng quan về enzyme lipase 5

2.2.1 Sơ lược về enzyme 5

2.2.2 Sơ lược về enzyme lipase 6

2.2.3 Đặc điểm cấu trúc enzyme lipase 7

2.2.4 Cơ chất của enzyme lipase 8

2.2.5 Các nguồn thu nhận enzyme lipase 10

2.2.6 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase 11

2.2.7 Ứng dụng của enzyme lipase 12

2.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly enzyme từ nội tạng cá lóc 15

2.3.1 Định nghĩa trích ly 15

2.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly rắn-lỏng 15

2.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly enzyme từ nội tạng 16

2.3.4 Một số nghiên cứu có liên quan 17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Phương tiện thí nghiệm 20

3.1.1 Địa điểm, thời gian 20

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 20

3.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 20

3.2 Phương pháp nghiên cứu 21

3.2.1 Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu 21

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 22

3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

3.3 Nội dung nghiên cứu 23

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23

3.3.2 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu 23

3.3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 24

3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 25

3.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc 26

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Thành phần hóa lý cơ bản của nội tạng cá lóc 29

4.2 Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 30

4.3 Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính enzyme trích ly từ nội tạng cá lóc 31

4.4 Ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc 32

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 44

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ 51

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Ứng dụng của enzyme lipase vi sinh vật 13Bảng 2.2: Một vài enzyme lipase thương mại có nguồn gốc vi sinh vật 14Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 22Bảng 3.2: Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm 27Bảng 3.3: Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly lipase từ nội tạng

cá lóc 27Bảng 4.1: Thành phần hóa lý cơ bản của nội tạng cá lóc 29Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến hoạt tính lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc 30Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính enzyme lipase trích ly

từ nội tạng cá lóc 31Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối với phương trình hồi quy 32

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc enzyme lipase 8

Hình 2.2: Phản ứng thủy phân hoặc tổng hợp của triacylglycerol được xúc tác bởi enzyme lipase 9

Hình 2.3: Hình phương pháp pH-stat 12

Hình 3.1: Nội tạng cá lóc 21

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23

Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 25

Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 26

Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian đến hoạt tính của enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 33

Hình 4.2: Đồ thị đường đồng điểm và bề mặt đáp ứng thể hiện sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 33

Hình 4.3: Đồ thị tương quan giữa hoạt tính lipase xác định bằng thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy 34

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, ngành công nghệ enzyme phát triển mạnh

mẽ và có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống và sản xuất Trên thế giới, những nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme đã bắt đầu từ thế kỉ 19 cho đến nay với nhiều enzyme được thương mại hóa gắn liền với những nhà sản xuất enzyme lớn như hãng Novo Nordisk (Đan Mạch), DuPont (Mỹ), Ashasi (Nhật Bản),… Riêng ở Việt Nam, việc nghiên cứu trích ly enzyme cũng đã được quan tâm nhưng chưa được ứng dụng vào thực tế sản xuất (Nguyễn Đức

Lượng và ctv, 2004)

Enzyme lipase (EC 3.1.1.3) là enzyme có vai trò ứng dụng quan trọng đứng thứ ba trên thế giới, chiếm 5% thị trường enzyme thương mại, chỉ sau

enzyme protease và carbohydrase (Trần Đăng Khoa và ctv, 2011) Đây là

enzyme có nhiều ứng dụng trong y dược học và các ngành công nghiệp khác

(Poonsuk and Thiraratana, 2008) Ngày nay, lipase được sản xuất từ nhiều

nguồn khác nhau như vi sinh vật, nấm mốc, nấm men, động vật và thực vật Đặc biệt, việc tận dụng những phụ phẩm trong sản xuất nông nghiệp, công nghiệp vào sản xuất enzyme đang là đề tài được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới

Với điều kiện tự nhiên thuận lợi, Việt Nam là một trong những quốc gia

có diện tích nuôi trồng cá lóc tương đối lớn trong khu vực Các sản phẩm chế biến từ cá lóc như: khô cá lóc, chả cá lóc, chà bông cá lóc,… ngày càng được

ưa chuộng trên thị trường Trong quá trình chế biến để lại một lượng lớn phụ phẩm nội tạng cá chứa hàm lượng enzyme lipase cao chưa được xử lý (Odedeyi, 2007) Do những vai trò quan trọng của enzyme lipase mà ngày nay

có nhiều ngành nông nghiệp, công nghiệp ứng dụng lipase trong sản xuất Tuy nhiên, giá thành của enzyme lipase trên thị trường hiện nay khá đắt, đặc biệt là những enzyme lipase có độ tinh khiết cao Vì thế, việc nghiên cứu, ứng dụng, sản xuất enzyme lipase từ nội tạng cá sẽ góp phần tạo ra cơ hội phát triển cho các quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam

Việc tận dụng nguồn phụ phẩm từ nội tạng cá lóc nuôi dồi dào để trích

ly enzyme lipase không chỉ có tiềm năng trong việc tạo ra nguồn enzyme nội tại có giá thành thấp mà còn góp phần nâng cao giá trị của cá lóc và hạn chế được vấn đề ô nhiễm môi trường của các nhà máy, cơ sở chế biến cá lóc

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xác định các thông số cơ bản trong quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc có hoạt tính cao

Các nội dung nghiên cứu chính của đề tài là:

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến sự thay đổi hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc

- Xác định ảnh hưởng của điều kiện trích ly enzyme lipase từ nội tạng các lóc bao gồm: ảnh hưởng của loại dung môi sử dụng (các dung dịch đệm), tương tác thời nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nguyên liệu

2.1.1 Giới thiệu về cá lóc

Cá lóc (cá quả, cá chuối, cá sộp, cá tràu, cá đô) là loài cá nước ngọt thuộc họ Channidae, có hai chi là Channa chiếm hơn 27 loài phân bố hầu hết ở các nước châu Á và Parachanna với 3 loài phân bố chủ yếu ở khu vực châu

Phi Ở Việt Nam, hai loài cá lóc chủ yếu là Channa maculata và Channa

argus Họ cá Channidae ở Đồng bằng sông Cửu Long có 4 loài là Channa gachua (cá Chành dục), Channa lucius (cá Dày), Channa striata (cá lóc đen), Channa micropeltes (cá lóc bông) Hai loài Channa striata (cá lóc đen) và Channa micropeltes (cá lóc bông) chiếm chủ yếu trong cơ cấu nuôi ở khu vực

Đồng bằng sông Cửu Long (Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung, 2010; Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993)

Một số loài cá lóc có kích thước tương đối nhỏ khoảng 17 cm, tuy nhiên một số loài có kích thước lớn hơn Cá lóc là loài cá ăn tạp, chúng có thể

ăn cả những con cá trưởng thành khác Theo Odo et al (2012) cá lóc là một

trong những nguồn protein rẻ nhất nên cá lóc đã trở thành nguồn cung cấp thực phẩm có giá trị, phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Nam Á và một số quốc gia châu Phi Ngày nay, nhiều loài

cá lóc bản xứ đã được giới thiệu ra thế giới Từ trước năm 1990, một loài cá lóc châu Á đã được đặt tên ở Oahu, Hawaii Những loài khác được tìm thấy và đặt tên ở Đông Nam Florida và hồ Maryland năm 2002 Cá lóc dần được biết đến ở nhiều nơi trên thế giới, từ các hòn đảo phía tây Ấn Độ Dương đến phía đông Hawaii và được xuất khẩu qua nhiều quốc gia trong đó có Canada và Hoa Kỳ Ngoài ra, một số loài cá lóc có kích thước nhỏ và có nhiều màu sắc trong số những loài cá lớn được sử dụng làm cá cảnh tương đối phổ biến ở

Nhật Bản và châu Âu (Walter et al., 2004).

2.1.2 Đặc điểm sinh học của cá lóc

2.1.2.1 Tính ăn

Cá lóc là loài cá dữ, phàm ăn và có tính ăn rộng Những con cá có cỡ

yếu ăn ấu trùng, côn trùng, tôm con, nòng nọc và các loài cá nhỏ khác Đối với

cá lóc có cỡ thân dài hơn 20 cm thường ăn cá tạp, ếch, nhái, tôm, (Ngô Trọng Lư, 2002)

Cá lóc thường ăn mạnh vào mùa hè và khi nhiệt độ giảm xuống dưới

nước ngọt (Ngô Trọng Lư, 2002)

2.1.2.2 Đặc điểm sinh sản

Cá lóc 12 tuổi sẽ bắt đầu sinh sản bằng hình thức đẻ trứng Trong 1 năm, cá có thể đẻ 5 lần, mỗi lần trong một mùa sinh sản cách nhau khoảng 15 ngày Sau mỗi lần đẻ, cá mẹ sẽ bảo vệ cá con khoảng một tháng rồi tiếp tục đẻ lần khác Ở miền Bắc, mùa sinh sản của cá lóc từ tháng 4 đến tháng 8, rộ vào tháng 4 và tháng 5 Cá lóc thường chọn đẻ trứng vào buổi sáng sớm ở những nơi yên tĩnh, có nhiều cây cỏ thực vật thủy sinh Trong môi trường tự nhiên, 3

bắt đầu tách đàn sống độc lập (Ngô Trọng Lư, 2002)

2.1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng

Cá lóc sống thích nghi tốt với ruộng đồng, ao hồ, sông suối, nơi có thực vật thủy sinh như rong, cỏ, lục bình và môi trường nước đục, nước tù đọng

Riêng đối với loài Channa micropeltes (cá lóc bông) còn có thể sống được

trong cả môi trường nước lợ và nhiễm phèn (Việt Chương, 2009)

Cá lóc lớn nhanh vào mùa xuân hè, vào thời gian này cá thường sống

với cá lóc 1 năm tuổi thường thân dài 15,8 cm và nặng 137 g, cá hai năm tuổi

2.1.3 Tình hình nuôi và tiêu thụ cá lóc hiện nay

Ở Việt Nam, thủy sản là một trong những ngành mũi nhọn Theo Tổng cục thống kê thủy sản tháng 11 năm 2011 thì diện tích nuôi thủy sản cả nước năm 2007 là 1.018.800 ha và năm 2010 là 1.066.000 ha Sản lượng thủy sản nuôi trồng cả nước năm 2007 là 2.124.600 tấn và đạt 2.706.800 tấn vào năm

2010 Cá lóc là một trong những đối tượng thủy sản nước ngọt được nuôi nhiều ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh, Kiên Giang, dưới dạng thâm canh, bán thâm canh và nuôi kết hợp với nhiều hình thức khác nhau như nuôi lồng bè, nuôi trong ao đất, mương rãnh,

trên ruộng lúa, (Đỗ Thị Thanh Hương và Ngô Tú Trinh, 2013) Cũng theo

thống kê năm 2009, ước tính sản lượng cá lóc ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long là 30.000 tấn, trong đó cá lóc bông là 7.500 tấn với hình thức nuôi tự

phát và qui mô nuôi nhỏ lẻ là chủ yếu (Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung,

2010) Với một sản lượng cá lóc tương đối lớn như hiện nay, những phần phụ phẩm như nội tạng, đầu, vảy, thường được sử dụng làm thức ăn gia súc hoặc thải ra môi trường gây ảnh hưởng xấu Vì thế, nghiên cứu trích ly, sản xuất và ứng dụng enzyme lipase từ nội tạng cá lóc không những mang lại giá trị kinh

tế cao mà còn góp phần giải quyết gánh nặng về môi trường

2.2 Tổng quan về enzyme lipase

2.2.1 Sơ lược về enzyme

Trong đó, enzyme được định nghĩa có bản chất là protein, đóng vai trò

là chất xúc tác sinh học, xúc tác các phản ứng sinh hóa xảy ra trong cơ thể sống Cho đến năm 1960, tổng lượng enzyme bán ra trên thế giới chỉ một vài triệu USD nhưng trong thời gian gần đây thị trường enzyme có sự tăng trưởng đáng kể Hiện nay trên thế giới có khoảng 12 nhà sản xuất enzyme chính và khoảng 400 nhà cung cấp nhỏ với khoảng 60% lượng enzyme cung cấp trên thế giới được sản xuất ở châu Âu Enzyme protease là enzyme được cung cấp trên thị trường với số lượng lớn nhất, gần 40% tổng lượng enzyme Trong khi

đó, lipase là một trong những enzyme tiêu biểu cho hầu hết các ứng dụng

trong đời sống và sản xuất (Sharma et al., 2001) Theo thống kê, giá trị buôn

bán enzyme lipase trên thị trường châu Âu là 31,6 triệu USD (Nguyễn Đức

Lượng và ctv, 2004; trích dẫn bởi Frost và Sullivan, 1992)

Mỗi enzyme có tính đặc hiệu và hiệu lực xúc tác lớn, nhờ có sự hiện của enzyme mà các phản ứng trong cơ thể sống diễn ra với tốc độ rất nhanh và hoàn toàn

2.2.1.2 Phân loại

Năm 1961, Hội Sinh hóa quốc tế đã họp và thống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp chính theo thứ tự sau:

- Lớp 1: Oxidoreductase: xúc tác cho phản ứng oxi hóa-khử

- Lớp 2: Transferase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị (vận chuyển nhóm, gốc hóa học)

- Lớp 3: Hydrolase: xúc tác cho phản ứng thủy phân

- Lớp 4: Lyase: xúc tác phản ứng phân cắt không cần nước, hoặc loại nước tạo thành nối đôi, hoặc kết hợp phân tử nước vào nối đôi

- Lớp 5: Isomerase: xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

- Lớp 6: Lygase: xúc tác các phản ứng tổng hợp chất hữu cơ, cần năng lượng do các hợp chất cao năng cung cấp

Mỗi lớp được chia thành nhiều tổ, mỗi tổ lại được chia thành nhiều nhóm Do đó trong bảng phân loại enzyme, trước tên enzyme thường có 4 số:

số thứ nhất chỉ lớp, số thứ hai chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm và số thứ tư chỉ enzyme Khi ghi tên một enzyme nào thường để trong dấu ngoặc đơn mã số của enzyme trong bảng phân loại gồm 4 số thêm tiếp đầu ngữ "E.C" viết tắt

của "Enzyme Commision" (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007)

Ngày nay, số enzyme được tìm ra và đặt tên ngày càng tăng: năm 1992

là 3.196 enzyme đến đầu năm 2003 con số này đã tăng lên hơn 4.000 enzyme, trong đó khoảng 200 enzyme thương mại đã được đưa vào sử dụng (Phạm Thị

Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007)

Ngoài ra, enzyme còn được phân loại dựa vào cấu tạo, chia enzyme thành 2 nhóm chính:

- Enzyme đơn giản (enzyme gồm một cấu tử): trong phân tử enzyme chỉ có chứa protein

- Enzyme phức tạp: gồm 2 phần:

+ Phần protein thuần: gọi là apoprotein hay apoenzyme

+ Phần phi protein: đây là những chất hữu cơ đặc hiệu có nhiệm vụ thúc đẩy quá trình xúc tác, nếu chất hữu cơ đặc hiệu này gắn chặt vào protein thì được gọi là nhóm phụ (prosthetic), nếu nó gắn không chặt và bị tách ra khỏi protein một cách dễ dàng thì gọi là coenzyme Coenzyme có thể là các acid nucleic, vitamin, kim loại,…

Đa số các enzyme có trong cơ thể thuộc loại đa cấu tử và thường có cấu trúc bậc bốn

2.2.2 Sơ lược về enzyme lipase

Enzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là một nhóm enzyme thủy phân các triglyceride thành diglyceride, monoglyceride hoặc glycerol và các acid béo Enzyme lipase là enzyme phân giải liên kết ester nhưng khác với enzyme esterase vì enzyme lipase chỉ hoạt động trên bề mặt liên pha dầu-nước và không thủy phân cơ chất hòa tan trong nhiều chất lỏng

(Nguyễn Sỹ Lê Thanh và ctv, 2006) Một enzyme lipase sẽ phân cắt liên kết

nhũ tương ester của glyceride và những acid béo mạch dài như triolein và

tripalmitin (Sharma et al., 2001) Enzyme lipase thuộc nhóm phụ enzyme thủy

phân có serine ở trung tâm hoạt động xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau Trong môi trường khan nước lipase có khả năng ester hóa rượu, đường, thiol

và amin tạo những ester có cấu trúc lập thể đặc trưng (Trần Đăng Khoa và ctv, 2011; được trích dẫn bởi Hansan et al., 2006 và Saxena et al., 1999)

So với các enzyme thủy phân khác như protease và carbohydrase, enzyme lipase từ cá ít được nghiên cứu hơn Hơn nữa, lipase từ những động vật dưới nước ít được nghiên cứu hơn so với động vật có vú, thực vật và vi

sinh vật (L'opez et al., 2001) Hoạt tính của enzyme lipase được nghiên cứu ở một số loài sinh vật dưới nước như tôm hùm (Brockerhoff et al., 1970), cua (Vonk, 1960), cá mập báo (Patton et al., 1977), cá hồi cầu vồng (Tocher and Sargent, 1984), cá tuyết Thái Bình Dương (Lie and Lambersten, 1985), hải cẩu (Raso and Hultin, 1988) và cá mòi (Mukundan et al., 1985)

2.2.3 Đặc điểm cấu trúc enzyme lipase

2.2.3.1 Cấu trúc phân tử

Lipase thuộc nhóm enzyme thủy phân serine trong cấu trúc có chứa

al., 2007)

Theo Polaina et al (2007), lipase được chia thành 2 lớp cấu trúc cơ

bản: một lớp tồn tại ở dạng không hoạt động, ở đó trung tâm hoạt động bị bao phủ bởi cấu trúc xoắn “lid” và lớp khác trung tâm hoạt động luôn được tiếp

xúc với dung môi (Hình 2.1) Lipozyme của Mucor miehei RM-IM là một

trong những lipase ở CO2 siêu tới hạn Lipase từ Novozymes, được cố định

trên nhựa trao đổi anion resin (IM) (Boel et al., 1998) Nó có thể sắp xếp lại

những acid béo ở vị trí sn-1 và sn-3 của triglyceride, chỉ những vị trí sn-2 được giữ lại

Hình 2.1: Cấu trúc enzyme lipase

(Nguồn: Woolley and Petersen, 2012)

Thí nghiệm động học cho rằng sự hoạt hóa lipase liên quan đến sự hình thành những ngăn cố định trên pha tiếp xúc ở những vùng xảy ra sự thủy phân

Ba vùng được đề xuất ở trung tâm hoạt động của những enzyme thủy phân chất béo: (1) vùng chịu trách nhiệm nhận biết bề mặt cơ chất; (2) vùng tham gia liên kết tương tác thủy phân với một phân tử cơ chất đơn trong pha không

tan; (3) vùng xúc tác (Chapus and Semeriva, 1976)

2.2.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme lipase

Trung tâm hoạt động của enzyme là một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất Cấu tạo trung tâm hoạt động

của enzyme hiện còn biết rất ít (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004) Các acid amin

thường tìm thấy trong trung tâm hoạt động của enzyme là cysteine, histidine,

serine, aspartic acid, glutamic acid và lysine (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn

Đoan Duy, 2011) Trung tâm hoạt động của enzyme lipase bao gồm bộ ba xúc tác serine, histidine và aspartate hoặc glutamate (Wong, 1995) Trong đó, sự

hiện diện của serine ở trung tâm được xem có tính bảo tồn cao (Lohse et al.,

1997)

2.2.4 Cơ chất của enzyme lipase

Theo Aravindan et al (2007), glyceride là cơ chất tự nhiên của lipase,

có chứa nhóm chức chiral alcohol, đặc hiệu cho sự phân giải những ester mang nhóm chiral không đối xứng Đây là enzyme có tính đặc hiệu nhóm tương đối Khi sử dụng dầu ăn làm cơ chất đặc hiệu, do các loại dầu khác nhau

về thành phần, hàm lượng acid béo, số liên kết no và không no nên đối với mỗi loại dầu khác nhau thì khả năng phân giải của cùng một lipase cũng khác

khau Trong nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Lê Thanh và Quyền Đình Thi (2007) cho kết quả enzyme lipase từ chủng Geotrichum sp DTQ-26.3 có hoạt tính

Nắp

Đầu N Trung tâm hoạt động

Đầu C

Colipase

đặc hiệu cao nhất đối với dầu olive, sau đó đến dầu Meizan, dầu Neptune, dầu đậu nành và cuối cùng là dầu mè

* Cơ chế phản ứng của enzyme lipase:

Enzyme lipase tham gia xúc tác nhiều phản ứng bao gồm phản ứng thủy phân, ester hóa, rượu hóa, acid hóa và amin hóa Trong dung môi hữu cơ, enzyme lipase cho hiệu quả xúc tác những phản ứng ester hóa nội phân tử và những phản ứng chuyển vị ester (Yapaşan, 2008) Một "lipase thật" sẽ phân cắt nhũ tương ester của glycerine và mạch acid béo dài như triolein và

tripalmitin (Aravindan et al., 2007) Quá trình xúc tác của enzyme lipase

thường xảy ra rất chậm so với quá trình xúc tác của các enzyme khác như protease hay amylase Sản phẩm của quá trình thủy phân nhờ sự xúc tác bởi

lipase là monoglyceride và acid béo (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Cơ

Hình 2.2: Phản ứng thủy phân hoặc tổng hợp của triacylglycerol được xúc tác

bởi enzyme lipase

(Nguồn: Thomson et al., 1999 được trích dẫn bởi Yapaşan, 2008)

Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv (2004), phản ứng xúc tác bởi lipase

giống với tác động thủy phân của serine protease

Cơ chất kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme theo hai giả thuyết:

- Thuyết chìa khóa và ổ khóa của Emil Fischer (1890) được thừa nhận trong một thời gian dài, thuyết này cho rằng trung tâm hoạt động của enzyme có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc của cơ chất giống như tương ứng giữa chìa khóa và ổ khóa

- Thuyết khớp cảm ứng của Daniel Koshland (1958): Theo quan niệm hiện nay và thực tế cũng đã chứng minh cấu trúc enzyme không cứng mà mềm dẻo, linh động Vì vậy, khi tương tác với cơ chất và các nhóm chức ở trung

Triacylglycerol

Lipase

tâm hoạt động enzyme có thể thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể

khớp với hình thể của cơ chất (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004)

2.2.5 Các nguồn thu nhận enzyme lipase

Ngày nay, enzyme lipase được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật như: vi

khuẩn, nấm men, nấm mốc, (Selvamohan et al., 2012) Ở sinh vật nhân thực,

enzyme lipase tham gia vào các giai đoạn khác nhau của quá trình chuyển hóa lipid bao gồm tiêu hóa chất béo, hấp thu, chuyển hóa lipoprotein,… Ở thực vật, enzyme lipase được tìm thấy trong các mô dự trữ năng lượng (Dương

Minh Lam và Vũ Thị Lý, 2012)

2.2.5.1 Lipase động vật

Năm 1923, lần đầu tiên Willstatter và Memmen đã tách thành công

lipase từ tuyến tụy của lợn Cho đến nay, các tính chất của enzyme lipase được nghiên cứu rất kỹ Tính chất của enzyme lipase động vật bao gồm khối lượng

(Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Cũng theo Dương Minh Lam và Vũ Thị Lý (2012), lipase từ tuyến tụy

là một trong những enzyme động vật được biết sớm trở thành mô hình cho những nghiên cứu về lipase động vật sau này và được sử dụng từ lâu như là một enzyme kỹ thuật trong y học Đồng thời, các lipase trong sữa biểu hiện hoạt tính xúc tác thủy phân glycerol chứa 1 gốc acyl (MAG) Trong số những enzyme lipase động vật được nghiên cứu thì lipase từ sữa người được nghiên cứu khá kỹ, đây là những esterase được kích hoạt bởi muối mật

2.2.5.2 Lipase từ thực vật

Lipase có ở nhiều loại thực vật, tuy nhiên những hiểu biết về lipase từ thực vật vẫn còn hạn chế so với lipase có nguồn gốc từ động vật và vi sinh vật Lipase thực vật là enzyme thủy phân các liên kết ester của triacylglycerol dự trữ trong hạt, đặc biệt là các loại hạt có dầu như hạt ngô, dừa, bông, đậu phộng, Triacylglycerol là nguồn năng lượng cung cấp cho quá trình nảy mầm của hạt Các lipase thực vật đã được nghiên cứu và tinh sạch như lipase

từ ngô, cải, đậu (Vulfson, 1994) Hiện nay, lipase từ thực vật đang được ứng

dụng trong chuyển đổi sinh học lipid (Dương Minh Lam và Vũ Thị Lý, 2012)

spp Đây là thành quả đầu tiên cho nghiên cứu, sản xuất enzyme lipase có

nguồn gốc từ vi sinh vật Nhiều tính chất của enzyme lipase nguồn gốc vi sinh

vật đã được nghiên cứu Trong đó, lipase từ Mucor sp hoạt động mạnh ở pH =

cylindrace có khối lượng phân tử 120.000 Da, điểm đẳng điện 4,2, hoạt động

mạnh ở pH = 55,8, nhiệt độ tối ưu 45oC, chế phẩm enzyme thương mại là

lipase AY (AM) (SA) Lipase từ Rhizopus sp có khối lượng phân tử 43.000

lipase D (AM) Lipase từ Pseudomonas sp có khối lượng phân tử 29.000 Da,

pH tối ưu 5,3 Trên thế giới, hiện nay có ba chế phẩm enzyme lipase được thương mại hóa là lipolact (AM), lipase AP (AM), lipozyme (NO) (Nguyễn

Đức Lượng và ctv, 2004)

Năm 1994, hãng Novo Nordisk đã giới thiệu lipase tái tổ hợp thương

mại đầu tiên-Lipolase có nguồn gốc từ nấm mốc Thermomyces lanuginosus (trước đây là Humicola lanuginosa) Năm 1995, tập đoàn Genencor của Đức

đã sản xuất thành công hai enzyme lipase có nguồn gốc vi sinh vật là

Lumafast từ P mendocina và Lipomax từ P alcaligenes (Aravindan et al.,

2007)

2.2.6 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase

Theo Lê Ngọc Tú và ctv (2004), có nhiều phương pháp xác định hoạt

tính enzyme Về nguyên tắc có thể chia ra ba phương pháp sau:

- Đo lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với nồng độ enzyme xác định

- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzyme nhất định

- Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Ứng dụng những nguyên tắc trên mà ngày nay có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme lipase như phương pháp đo quang phổ, phương pháp chuẩn độ, phương pháp sắc ký, phương pháp phóng xạ, phương pháp sức căng bề mặt, phương pháp đục kế, phương pháp đo độ dẫn

điện, phương pháp hóa học miễn dịch, phương pháp hiển vi, (Arpigny and

Jaeger, 1999) Trong đó, phương pháp chuẩn độ pH-stat được biết đến là một trong những phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase đạt hiệu quả cao nhất Với phương pháp pH-stat, hoạt tính của enzyme lipase được xác định trên một máy khuấy trộn hệ nhũ tương của những triacylglyceride tự nhiên hay tổng hợp bằng việc trung hòa những acid béo tự do được giải phóng theo thời gian bằng sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì pH tại một giá trị điểm cuối không đổi Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá chính xác trong giới hạn 1 µmol acid béo giải phóng ra trong 1 phút Tuy nhiên, khi sử dụng NaOH 0,1 M làm chất chuẩn độ thì phương pháp này không đáng tin cậy để nhận biết mức độ hoạt động nhỏ hơn 0,1 µmol/phút Ngoài tính nhạy thấp, phương pháp pH-stat còn có nhược điểm là vùng phân

bố hẹp của những giá trị pH Bên cạnh đó, sự phát hiện những giá trị pH của proton được giải phóng suốt thời gian thủy phân được xúc tác bởi enzyme lipase thì cần có quá trình ion hóa một phần acid béo được giải phóng Vì thế, những giá trị pH ở điểm cuối của môi trường phản ứng phải gần bằng nhau, hoặc cao hơn giá trị pKa của acid béo được giải phóng Khả năng ion hóa cũng như sự có mặt của những ion Ca2+ sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá trị pKa hiển thị Trong một số trường hợp, sự có mặt của những ion

dài (Beisson et al., 2000)

Hình 2.3: Hình phương pháp pH-stat

(Nguồn: Beisson et al., 2000)

Cũng theo Paul (1991), phương pháp chuẩn độ liên tục pH-stat được ứng dụng rộng rãi để xác định hoạt tính enzyme lipase từ gan tụy bằng cách xác định những proton giải phóng ra ở pH 9 ở nhiệt độ phòng từ nhũ tương là dầu olive được ổn định bởi gum arabic

2.2.7 Ứng dụng của enzyme lipase

Enzyme lipase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: thực phẩm, hóa học, mỹ phẩm, dược phẩm, thuộc da, chất tẩy rửa, sản xuất biodiesel, sản xuất các polymer phân hủy sinh học, y học ứng dụng, công

nghiệp giấy và chế tạo các biosensor (Vieira et al., 2006; Hasan et al., 2006; Starace et al., 1983; Trần Thị Bé Lan và ctv, 2012) Mức độ ứng dụng của

enzyme lipase đứng thứ ba (5%) trên thế giới sau protease và carbohydrase

(Trần Đăng Khoa và ctv, 2011) Trong thủy phân dầu hoặc các chất béo khác,

enzyme lipase chủ yếu là các lipase từ vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là ở Nhật Hiện nay, đã có 34 công nghệ ứng dụng trên toàn thế giới với khoảng 60 triệu tấn dầu, chất béo đang được xử lý bằng phương pháp enzyme

Các lipase chủ yếu được sản xuất từ Candida cylindraceal Bên cạnh đó, người ta còn sản xuất lipase từ Rhizopus sp., Aspergillus sp., Mucor sp.,…

Quá trình thủy phân bởi enzyme lipase xảy ra với hiệu suất hoàn toàn không

Điện cực thủy tinh NaOH

giống nhau, phụ thuộc vào nguồn cung cấp dầu và chất béo (Nguyễn Đức

Lượng và ctv, 2004)

Bảng 2.1: Ứng dụng của enzyme lipase vi sinh vật

Chất tẩy rửa Thủy phân chất béo Loại bỏ vết dầu trên các loại vải Các sản phẩm từ sữa Thủy phân chất béo sữa, làm

chín phomai, thay đổi thành phần bơ sữa

Tăng cường hợp chất tạo hương vị cho sữa, bơ và phomai

whippings Thực phẩm dinh

dưỡng

Chuyển hóa ester Thực phẩm dinh dưỡng

Thịt và cá Cải thiện mùi vị Sản phẩm thịt, cá, các loại mỡ Dầu béo Chuyển hóa ester, thủy phân Bơ ca cao, bơ thực vật, acid béo,

glycerol, mono và diglyceride Hóa chất Phản ứng tổng hợp đặc hiệu Hợp chất vòng chiral, hóa chất Dược phẩm Chuyển hóa ester, thủy phân Chất hỗ trợ tiêu hóa, trao đổi chất

(Nguồn: Vulfson, 1994)

Ngày nay, có nhiều enzyme lipase thương mại có nguồn gốc vi sinh vật được sản xuất và được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp chất hữu cơ, Các hãng sản xuất enzyme lipase trên thế giới như Novo Nordisk, Fluka, Ashasi,

Bảng 2.2: Một vài enzyme lipase thương mại có nguồn gốc vi sinh vật

Nấm mốc

C rugosa Tổng hợp chất hữu cơ

Amano, Biocatalysts, Boehringer Mannheim, Fluka, Genzyme, Sigma

C antarctica Tổng hợp chất hữu cơ Boehringer Mannheim,

Mannheim

P alcaligenes Bổ sung vào chất tẩy rửa Genencor

P mendocina Bổ sung vào chất tẩy rửa Genencor

Ch viscosum Tổng hợp chất hữu cơ Asahi, Biocatalysts

(Nguồn: Jaeger and Reetz, 1998)

2.2.7.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Hầu hết các enzyme lipase thương mại được sử dụng cho phát triển hương vị trong các sản phẩm và các quá trình sản xuất thực phẩm khác như

thịt, rau quả, trái cây, thực phẩm nướng, sản xuất sữa và bia, (Selvamohan et

al., 2012)

Bên cạnh đó, lipase còn được dùng để cải thiện và tăng giá trị sử dụng cho những chất béo có giá trị không cao, sản xuất chất béo thay thế bơ ca cao-

một thành phần quan trọng trong sản xuất chocolate, cố định Rhizomucor

miehei thực hiện phản ứng trao đổi ester thay thế acid palmitic của dầu cọ

bằng acid stearic, giảm hàm lượng acid béo mạch dài và tăng phù hợp ở những phân tử C18:0 và C18:1 tại vị trí thứ 2 của các triacylglycerol được chọn và sử dụng polyunsaturated fatty acid (PUFA) trong dược phẩm và thực phẩm chức

năng (Colman and Macrae, 1980; Pabai et al., 1995a; Pabai et al., 1995b; Undurraga et al., 2001)

2.2.7.2 Công nghiệp chất tẩy rửa

Enzyme lipase được sử dụng trong công nghiệp chất tẩy rửa chiếm gần 32% tổng lượng enzyme lipase bán ra trên thị trường Để sử dụng làm chất tẩy rửa lipase phải đáp ứng được các yêu cầu sau: không có tính đặc hiệu cơ chất,

có khả năng thủy phân chất béo có các thành phần khác nhau, chịu được điều

bởi các chất hoạt động bề mặt và các enzyme khác (Sharma et al., 2001) Theo

ước tính mỗi năm có khoảng 1.000 tấn lipase được thêm vào để sản xuất gần

13 tỉ tấn chất tẩy rửa mỗi năm (Jaeger and Reetz, 1998)

2.2.7.3 Công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy

Enzyme lipase đang được nghiên cứu sử dụng cho quá trình khử mực giấy in báo do khả năng thủy phân mực in dầu, tách hiệu quả các loại mực mà không làm ảnh hưởng đến tính chất xơ sợi Một số chế phẩm enzyme thương

mại như Resinase A2X từ chủng Thermomyces lanuginosus (Novozym), Lipex từ chủng Fusarium oxysporum (Novozym), Optimyze từ chủng

Magnaporthe grisea (Buckman) đã được nghiên cứu với tỉ lệ phù hợp đem lại

hiệu quả tách mực và hiệu suất thu hồi bột tương đối cao (Lê Thị Huỳnh Hoa,

2011)

Những thành phần kỵ nước trong gỗ chủ yếu là triglycerides và sáp là nguyên nhân gây ảnh hưởng đến quá trình sản xuất giấy và bột giấy (Jaeger

and Reetz, 1998) Enzyme lipase được sử dụng để loại bỏ những thành phần

kỵ nước trong bột giấy của quá trình sản xuất giấy Công ty sản xuất giấy Nippon của Nhật Bản đã ứng dụng thành công phương pháp điều khiển các thành phần kỵ nước bằng cách sử dụng enzyme lipase có nguồn gốc từ nấm

mốc Candida rugosa, hiệu suất thủy phân hàm lượng triglycerides có trong gỗ lên đến 90% (Sharma et al., 2001)

2.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly enzyme từ nội tạng cá lóc 2.3.1 Định nghĩa trích ly

Trích ly là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong chất lỏng hay trong chất rắn bằng một chất lỏng khác gọi là dung môi Nếu quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng bằng một chất lỏng khác thì gọi là trích ly lỏng-lỏng Nếu quá trình tách chất hòa tan trong chất rắn bằng một chất lỏng thì gọi

là trích ly rắn-lỏng (Nguyễn Bin, 2008) Trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc là quá trình trích ly rắn-lỏng: tách enzyme lipase (bản chất những phân tử protein) từ nội tạng cá lóc

Theo Nguyễn Bin (2008), quá trình trích ly được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt là ngành công nghiệp hóa chất và thực phẩm với mục đích chính là tách các cấu tử quý từ chất rắn ban đầu (trích

ly rắn-lỏng)

2.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly rắn-lỏng

Quá trình hòa tan một số cấu tử từ chất rắn gọi là quá trình hòa tan lỏng Trong công nghiệp dung môi thường dùng là nước hoặc một hỗn hợp của nước (Nguyễn Bin, 2008)

rắn-Trong bất kỳ một quá trình trích ly rắn-lỏng nào cũng bao gồm các giai đoạn: dung môi thâm nhập vào các mao quản của vật thể rắn, sau đó chất tan

và dung môi khuếch tán vào dung dịch từ vật thể rắn Đôi khi chất hòa tan

chứa trong các mao quản của vật thể rắn ở dạng dung dịch lỏng, trường hợp này chất hòa tan được chuyển trực tiếp vào dung môi bằng khuếch tán (Nguyễn Bin, 2008)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly rắn-lỏng là: hình dạng, kích thước, thành phần hóa học của chất rắn, cấu trúc bên trong của chất rắn,…

2.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly enzyme từ nội tạng

2.3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nguyên liệu

Theo Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn (2006), khi tăng lượng dung

môi thì quá trình trích ly enzyme từ nguyên liệu vào dung môi sẽ trở nên dễ dàng hơn Tuy nhiên, khi thay đổi tỉ lệ nguyên liệu và nước cất sử dụng trong quá trình trích ly thì giá trị pH dịch trích cũng thay đổi theo và ảnh hưởng đến

độ hòa tan và khả năng khuếch tán của các protein từ nguyên liệu vào dịch trích

2.3.3.2 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường phản ứng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền cấu

trúc protein (Nguyễn Sỹ Lê Thanh và Quyền Đình Thi, 2007) Tại điểm đẳng

điện pH = pI, enzyme bị biến tính dẫn đến không còn hoạt tính sinh học Mỗi

loại dung môi có khoảng pH thích hợp Theo Shivika và Shamsher (2014),

việc sử dụng dung môi hữu cơ có nhiều ưu điểm: tăng khả năng hoạt động và

sự ổn định của enzyme, tăng khả năng hòa tan cơ chất, dễ dàng phục hồi sản phẩm, tăng khả năng dịch chuyển cân bằng theo hướng tổng hợp Do đó, những nghiên cứu về sử dụng dung môi hữu cơ trong enzyme ngày càng rộng rãi

2.3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly

Thời gian thủy phân phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc protein, kích thước nguyên liệu, các yếu tố tác động đến sự khuếch tán enzyme vào dung môi,… Đồng thời, ở cùng một tỉ lệ dung môi sử dụng nếu thời gian trích

ly ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyên liệu (Rao et al.,

2010)

2.3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly

Nếu đưa nhiệt độ trích ly cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme bị giảm và không có khả năng phục hồi hoạt tính, nguyên nhân là do dưới tác động của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hưởng đến hoạt tính Nhiệt độ cao có thể làm một số liên kết hydrogen trong mạng lưới liên kết hydrogen tham gia vào việc giữ cấu trúc của enzyme lipase bị đứt gãy

làm giảm hoạt tính enzyme (Nguyễn Sỹ Lê Thanh và Quyền Đình Thi, 2007)

đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng trở lại (Nguyễn Đức Lượng và

ctv, 2004)

2.3.3.5 Ảnh hưởng của khuấy trộn đến hiệu quả trích ly

Khuấy trộn giúp tăng khả năng khuếch tán của nguyên liệu nội tạng cá lóc vào dung môi, quá trình này được thực hiện bằng máy khuấy từ Theo

Gábor et al (2007), máy khuấy từ là một thiết bị thường được sử dụng trong

các phòng thí nghiệm để khuấy trộn các nguyên liệu khác nhau, hòa tan vào trong chất lỏng Cấu tạo của máy khuấy từ gồm một nam châm quay với tần số được điều chỉnh xung quanh một trục thẳng đứng dưới mặt phẳng nằm ngang Quá trình quay, nam châm tạo ra vòng xoáy cuốn nguyên liệu và chất lỏng đi theo, gây tác động cơ học giúp hòa tan nguyên liệu vào chất lỏng làm tăng hiệu quả trích ly

2.3.4 Một số nghiên cứu có liên quan

Ngày nay, có nhiều nghiên cứu về enzyme lipase chủ yếu tập trung vào đặc điểm cấu trúc, cơ chế hoạt động, động lực học, trình tự và nhân bản gen

của enzyme lipase (Alberghina et al., 1991; Bezzine et al., 1998; Bornscheur,

2000) Các nghiên cứu về lipase tập trung nhiều nhất ở phương diện sinh tổng

hợp lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc (Sumathy et al., 2012)

Việc xác định sự hiện diện của lipase trong cá lóc cũng đã được các nhà

khoa học quan tâm từ thập niên 70, 90 của thế kỷ 20 Olatunde và Ogunbiyi

(1977) cho thấy, có sự vắng mặt của enzyme lipase trong thực quản và trực

tràng của cá lóc và một số loài cá có họ Paracahanna Kết quả nghiên cứu của Fagbenro (1990) về hai loài cá Heterotist niloticus và Clarias isheriensis cho

thấy, sự tiêu hóa chất béo luôn hoàn thành trong tá tràng do hoạt tính enzyme lipase thu được trong vùng này rất cao, trong khi đó lipase chỉ hiện diện ở phổi với mức trung bình và rất thấp ở dạ dày Nghiên cứu gần đây nhất của

Odedeyi (2007) cho thấy, trong nội tạng cá lóc Paracahanna obscura có

những enzyme chính như glycosidase, protease và lipase để tiêu hóa thức ăn Trong đó, lipase được chứng minh có hoạt tính cao nhất và tỷ lệ thuận với tỷ

lệ chất béo có trong thức ăn

Việc nghiên cứu thu nhận lipase từ nguồn động vật, đặc biệt là thủy sản

cũng được tiến hành ở những loài cá khác Prasertsan và Prachumratana

(2008) đã so sánh và lựa chọn những nguồn protease và lipase từ các bộ phận

nội tạng của ba loài cá ngừ Thunnus albacares, Katsuwonus pelami và

Thunnus albacares Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính enzyme lipase cao

quan nội tạng như dạ dày, gan, tụy, lách, thì tuyến tụy cho giá trị hoạt tính

Görgün1 và Akpınar (2012) đã nghiên cứu trích ly và xác định tính chất của lipase từ gan của cá chép Cyprinus carpio L (1758) Nghiên cứu đã đề

xuất quá trình thu nhận lipase bằng hỗn hợp dung môi Tris-HCl 60 mM, Mannit 0,25 mM và Na4EDTA 1 mM có pH 7,4 với tỷ lệ dung môi và nguyên liệu là 3:1 (w/w) Kutrovic (2011) cũng đã khẳng định hiệu quả trích ly lipase

D-từ nội tạng cá hồi (Oncorhynchus tshawytscha) và cá Hoki (Macruronus

novaezelandiae) Kết quả khảo sát đã cho thấy, hiệu quả trích ly đạt được tốt

nhất khi nguyên liệu được cấp đông nhanh bằng nitrogen lỏng hay cấp đông ở

(phosphate 100 mM có pH 7,8 chứa benzamidine 2 mM, EDTA 1 mM và glycerol 20%, w/v), tỷ lệ dung môi và nguyên liệu là 3:1 và thời gian trích ly

là 90 phút Hoạt tính lipase thu được thấp và không ổn định khi sử dụng dung môi trích ly là 25 mM Tris-HCl, 2 mM benzamidine and 1 mM EDTA ở pH trong khoảng 8-9 Kutrovic (2011) cũng khẳng định việc hạ thấp pH trích ly so với pH tối thích cho hoạt động của enzyme giúp lipase thu nhận có tính ổn định và hoạt tính cao

Islam et al (2009) đã có những nghiên cứu trong tinh sạch và xác định tính chất sinh học của enzyme lipase từ phần lưng của loài cá trôi (Cirrhinus

reba) Nhiều phương pháp tinh sạch được sử dụng kết hợp như: kết tủa phân

đoạn bằng muối (NH4)2SO4 85%, siêu lọc, sắc ký lọc gel Sephadex G-50 và DEAE-celluloase Khối lượng phân tử của enzyme là 87 kDa được xác định bằng phương pháp lọc gel trên Sephadex G-150 và điện di trên mặt phẳng gel SDS-polyacrylamide Sau khi tinh sạch, enzyme lipase hoạt động trong khoảng pH 4,5÷5,5 và đạt pH tối ưu là 5,5 và khoảng nhiệt độ 30÷60oC với

Ở Việt Nam, nghiên cứu thu nhận lipase cũng đã được quan tâm trong

những năm gần đây Nghiên cứu của Trần Thị Bé Lan và ctv (2012) trong so sánh một số tính chất của chế phẩm lipase từ Candida rugosa và Procine

pancreas về khối lượng phân tử, điểm đẳng điện, hàm lượng protein và các

điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân enzyme lipase như: nhiệt độ, pH, ảnh

(2008) đã nghiên cứu về trích ly lipase từ nội tạng cá tra Kết quả nghiên cứu

trích ly là 1: 2,5 (theo khối lượng) thu được dịch trích có hoạt tính riêng của

lipase cao nhất là 1,4257 (mol/h.mg)

Vương Bảo Thy và ctv (2011) cũng đã chứng minh hiệu quả của việc

thu nhận lipase từ nội tạng cá tra Nghiên cứu này sử dụng Tris-HCl pH 8,0 làm dung môi trích ly với tỷ lệ dung môi và nguyên liệu là 2:1 (w/w) Khi tiến

hành thu nhận lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius), Vương Bảo Thy và ctv

(2013) cũng đề xuất điều kiện trích ly tương tự như khi sử dụng toàn bộ nội tạng làm nguyên liệu thu nhận lipase

Nghiên cứu thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc của Tran et al (2014) đã

cho thấy hiệu quả trích ly lipase đạt tốt nhất khi sử dụng dung môi trích ly có

pH = 6, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là 1: 4 (w/w), thời gian trích ly

đến đặc điểm của dung dịch đệm sử dụng để trích ly, đồng thời nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình trích ly cũng chỉ được khảo sát riêng lẻ Chính vì vậy, việc nghiên cứu một cách chi tiết về đặc điểm của dung môi trích ly cũng như tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian trích ly lipase từ nội tạng cá lóc cần được quan tâm,…

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện thí nghiệm

3.1.1 Địa điểm, thời gian

Thí nghiệm được tiến hành bố trí, theo dõi và xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 08/08/2014 đến tháng 30/11/2014

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị

- Pipet 10 mL, 20 mL, Đài Loan

- Máy khuấy từ Toshiba, model Magnestir MG-10, Nhật

- Máy khuấy từ nhiệt, model AHYQ 78-1, Trung Quốc

- Máy đo pH 2 số lẻ, model HANA pH 212, độ chính xác 0,01, Ý

- Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01 g, Nhật

- Máy xay thịt Gali, model KD-N19, công suất 1.000 W, Trung Quốc

3.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm

Trung Quốc

- Dầu olive, độ tinh khiết 100%, Ý

- Gum arabic KB-12, Việt Nam

- HCl đậm đặc, độ hoà tan 37%, Việt Nam

Trung Quốc

Trung Quốc

- Sodium hydroxide (NaOH) chuẩn 0,05 N, Việt Nam

- Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, độ tinh khiết

≥99,0%, Trung Quốc

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu

Nội tạng cá lóc được thu mẫu trực tiếp tại các điểm mua bán cá lóc ở các chợ trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ (4 chợ: chợ Xuân Khánh, chợ Cái Khế, chợ Trần Việt Châu và chợ An Bình, thu mẫu ở 4÷6 điểm bán cá/chợ) Thời gian thu mẫu vào buổi sáng sớm (từ 6 giờ đến 7 giờ 30 phút) Khối lượng mẫu được trung bình thu được trong một ngày khoảng 0,9 đến 1,1 kg

Toàn bộ phần nội tạng sau khi được lấy ra khỏi thân thịt cá sẽ được chuyển trực tiếp sang dụng cụ chứa – bao bì PE đặt trong thùng xốp hay thùng

đến phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ

A: Trước xử lý B: Sau xử lý

Hình 3.1: Nội tạng cá lóc

Ở phòng thí nghiệm, nguyên liệu được qua các bước xử lý sơ bộ loại bỏ

mang, mỡ, bụi bẩn, (Hình 3.1) Nội tạng cá lóc thu được ở tất cả các nơi

được trộn lẫn để đảm bảo tính đồng nhất Cân, phân chia khối lượng mỗi mẫu

là 200 g Tiến hành lạnh đông nhanh nguyên liệu ở hệ thống tủ cấp đông có

trung bình là 50÷55 phút) Mẫu sau cấp đông được đưa vào tủ trữ đông có nhiệt độ -18oC

Trước khi tiến hành thí nghiệm, mẫu nội tạng lạnh đông được nghiền, xay để phá vỡ cấu trúc, cân định lượng khối lượng mỗi mẫu theo từng nghiệm thức khảo sát

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả

Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả

4328-1:2007 (phụ lục 1) Lipid tổng số, % Xác định bằng phương pháp Soxhlet, Tiêu chuẩn Việt Nam

4331:2001 (phụ lục 1)

3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu

nghiệm trước được sử dụng làm thông số cố định cho các thí nghiệm kế tiếp

Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution 15.2, Copyright (C) PP, USA và phần mềm Excel Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức